Kalkulator koncentracije proteinov | A280 do mg/mL

Kalkulator koncentracije beljakovin

Kalkulator koncentracije beljakovin pretvori odčitek absorpcije svetlobe s spektrofotometra v količino beljakovin, raztopljenih v raztopini. Rezultat je običajno podan v miligramih na mililiter (mg/mL) ali mikrogramih na mililiter (μg/mL). Izračun temelji na Beer-Lambertovem zakonu, povezavi v kemiji, ki povezuje količino absorbirane svetlobe v vzorcu s količino snovi, ki jo vzorec vsebuje.

Kako se meri koncentracija beljakovin

Večina beljakovin močno absorbira ultravijolično svetlobo pri valovni dolžini 280 nanometrov (nm). To absorpcijo povzročata predvsem aminokislini triptofan in tirozin, ki sta prisotni v zgradbi beljakovine. Spektrofotometer pošlje svetlobo skozi vzorec in izmeri, koliko je vzorec absorbira. Ta odčitek se imenuje absorbanca oziroma A280, kadar je meritev izvedena pri 280 nm.

Merjenje absorbance pri 280 nm je hitro in ne uniči vzorca. Po tem se razlikuje od kemijskih metod, kot sta testa Bradford in BCA, opisana v nadaljevanju. Metoda je najprimernejša za prečiščeno beljakovino v raztopini z odčitkom absorbance med približno 0,1 in 1,0. Odčitki zunaj tega območja so manj zanesljivi, zato je treba vzorec pred merjenjem pogosto razredčiti.

Formula za koncentracijo beljakovin

Kalkulator preuredi Beer-Lambertov zakon, da izračuna koncentracijo:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — koncentracija beljakovin v mg/mL
• A — absorbanca pri 280 nm (golo število brez enote)
• DF — faktor redčenja, ki pove, kolikokrat je bil prvotni vzorec razredčen pred merjenjem
• ε — ekstinkcijski koeficient, konstanta, značilna za posamezno beljakovino, v L/(g·cm)
• l — dolžina optične poti, razdalja, ki jo svetloba prepotuje skozi vzorec, v cm (običajno 1 cm v standardni kiveti, majhni stekleni ali plastični posodici, ki se uporablja v spektrofotometru)

Za pretvorbo rezultata v mikrograme na mililiter vrednost v mg/mL pomnožimo z 1.000. Skupno maso beljakovin v vzorcu dobimo tako, da koncentracijo pomnožimo s prostornino vzorca v mililitrih.

Primer z rešitvijo

Vzorec ima absorbanco 0,5 pri 280 nm. Ni bil razredčen, zato je faktor redčenja 1, meritev pa je bila izvedena v standardni kiveti velikosti 1 cm. Beljakovina je goveji serumski albumin (BSA), ki ima ekstinkcijski koeficient 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

V vzorcu prostornine 1 mL je to približno 0,75 mg skupnih beljakovin oziroma 750 μg/mL.

Ekstinkcijski koeficienti pogostih beljakovin

Vsaka beljakovina absorbira svetlobo drugače, ker ima različno število ostankov triptofana in tirozina. Ekstinkcijski koeficient to opisuje za določeno beljakovino pri 280 nm in je izražen v enotah L/(g·cm). Pogosto uporabljene vrednosti vključujejo:

Kalkulator lahko sprejme tudi poljuben ekstinkcijski koeficient za beljakovino, ki ni na tem seznamu. Pri beljakovini z znanim zaporedjem aminokislin je mogoče to vrednost oceniti s formulo, ki sta jo Gill in von Hippel objavila leta 1989: ε₂₈₀ = (število ostankov triptofana × 5.500) + (število ostankov tirozina × 1.490) + (število ostankov cistina × 125). Formula da rezultat v M⁻¹cm⁻¹, molarni enoti, ki se razlikuje od zgornjih masnih vrednosti v L/(g·cm). Brezplačna orodja, kot je ProtParam na strežniku ExPASy, to vrednost izračunajo neposredno iz zaporedja beljakovine.

Dolžina optične poti in faktor redčenja

Dolžina optične poti je širina kivete, v kateri je vzorec, izmerjena v centimetrih. Standardne kivete so široke 1 cm. Mikrovolumenski spektrofotometri, ki merijo zelo majhne vzorce, lahko uporabljajo precej krajšo optično pot, na primer 0,1 cm.

Faktor redčenja upošteva vsako redčenje, izvedeno pred merjenjem. Če bi imel koncentrirani vzorec absorbanco nad 1,0, ga je običajno najprej treba razredčiti s pufrom. Faktor redčenja je enak skupni prostornini razredčene raztopine, deljeni s prostornino prvotnega vzorca. Če na primer zmešamo 10 μL vzorca z 990 μL pufra, dobimo skupno prostornino 1.000 μL in faktor redčenja 100.

Drugi načini merjenja koncentracije beljakovin

Absorbanca pri 280 nm je ena od več običajnih metod, ki se uporabljajo v laboratoriju.

• Bradfordov test: uporablja barvilo, ki spremeni barvo, ko se veže na beljakovino. Dobro deluje pri neprečiščenih vzorcih, vendar se lahko sprememba barve med različnimi beljakovinami razlikuje.
• BCA-test: temelji na spremembi barve, ki jo povzročijo peptidne vezi v beljakovini. Združljiv je s številnimi detergenti, vendar izvedba traja dlje kot neposredni odčitek absorbance.
• Lowryjeva metoda: starejša metoda, ki je zelo občutljiva, vendar se slabo odziva na nekatere običajne sestavine pufrov.

Vse tri metode uničijo vzorec. Neposredno merjenje A280 ga ne, zato je mogoče isti vzorec pridobiti nazaj in ga ponovno uporabiti.

Pogosta vprašanja

Kakšno je idealno območje absorbance za to metodo?

Med 0,1 in 1,0. Pod 0,1 je odčitek nenatančen. Nad 1,0 povezava med absorbanco in koncentracijo morda ni več linearna, zato je treba vzorec najprej razredčiti.

Zakaj meriti pri 280 nm namesto pri 260 nm?

Nukleinske kisline, kot sta DNK in RNK, močno absorbirajo pri 260 nm. Beljakovine zaradi vsebnosti triptofana in tirozina bolj absorbirajo pri 280 nm. Merjenje pri 280 nm zmanjša motnje zaradi morebitnih nukleinskih kislin v vzorcu.

Kako se določi ekstinkcijski koeficient za beljakovino, ki ni na seznamu?

Pri beljakovini z znanim zaporedjem ga orodje, kot je ProtParam, izračuna iz števila ostankov triptofana, tirozina in cistina. Izmeriti ga je mogoče tudi neposredno, tako da se absorbanca vzorca primerja z raztopino znane koncentracije.

Ali ta metoda deluje za zmes beljakovin?

Najbolje deluje za eno samo prečiščeno beljakovino z znanim ekstinkcijskim koeficientom. Zmes neznanih beljakovin, kot je celični lizat, se običajno meri s testom Bradford ali BCA, saj ti metodi zagotavljata bolj dosledno oceno skupne količine beljakovin.

Ali lahko detergenti motijo odčitek?

Da. Številni detergenti absorbirajo svetlobo v bližini 280 nm, kar lahko izkrivi rezultat. Uporaba slepega vzorca z enako koncentracijo detergenta pomaga izničiti absorbanco ozadja. Pri zelo visokih koncentracijah detergenta je morda primernejši test, združljiv z detergenti, na primer BCA.