Kalkulator kopijskega števila DNA | Orodje za genomsko analizo

Kalkulator števila kopij DNK

Kalkulator števila kopij DNK oceni, koliko kopij ciljne sekvence je v vzorcu DNK. Uporablja koncentracijo in prostornino vzorca ter podatek, kolikokrat se ciljna sekvenca pojavi znotraj daljše sekvence DNK. Laboratoriji za molekularno biologijo takšno oceno uporabljajo za načrtovanje poskusov, kot je qPCR (kvantitativna verižna reakcija s polimerazo), še preden izvedejo dražjo in natančnejšo analizo.

Kaj pomeni število kopij DNK

Število kopij DNK je število pojavitev določene sekvence v genomu ali vzorcu. Običajni človeški gen se pojavi dvakrat, enkrat podedovan od vsakega starša. To število lahko spremeni več dejavnikov.

• Amplifikacija: več kot dve kopiji. Rakave celice pogosto pomnožijo gene, ki spodbujajo rast, na primer HER2 pri nekaterih tumorjih dojke.
• Delecija: manj kot dve kopiji, včasih nič. Delecije lahko povzročijo genetske motnje.
• Podvojitev: pojavi se dodatna kopija tam, kjer bi morala biti le ena ali dve.
• Variacija števila kopij (CNV): običajna razlika v številu kopij med posamezniki, ki se pojavlja v pomembnem deležu človeškega genoma.

Formula za število kopij DNK

Kalkulator s to formulo iz števila pojavitev sekvence in mase vzorca izračuna število kopij:

$\text{Število kopij} = \frac{\text{Pojavitve} \times \text{Koncentracija} \times \text{Prostornina} \times N_A}{\text{Dolžina DNK} \times 660 \times 10^{9}}$

Pri tem:

• Pojavitve — kolikokrat se ciljna sekvenca pojavi v celotni sekvenci DNK; prekrivajoča se ujemanja se štejejo ločeno.
• Koncentracija — koncentracija DNK v nanogramih na mikroliter (ng/μL), običajno izmerjena s spektrofotometrom ali fluorometrom.
• Prostornina — prostornina vzorca v mikrolitrih (μL).
• $N_A$ — Avogadrova konstanta, 6,022 × 10²³ molekul na mol. Mole DNK pretvori v število molekul.
• Dolžina DNK — dolžina celotne sekvence DNK v baznih parih.
• 660 — povprečna molekulska masa enega baznega para DNK, izražena v gramih na mol (g/mol). Bazni par sestavljata dva sparjena nukleotida, po eden iz vsake verige DNK.
• 10⁹ — pretvori nanograme v grame.

Formula najprej pretvori maso vzorca v mole DNK, jih pomnoži z Avogadrovo konstanto, da dobi skupno število molekul DNK v vzorcu, nato pa rezultat pomnoži s številom pojavitev ciljne sekvence v posamezni molekuli.

Orodje sprejema samo črke A, T, C in G. Presledki in prelomi vrstic se prezrejo, male črke pa štejejo enako kot velike.

Kako izračunati število kopij DNK: primer izračuna

Vzemimo 12-baznoparno sekvenco DNK, ATCGATCGATCG, s ciljno sekvenco ATCG, koncentracijo 10 ng/μL in prostornino 20 μL.

Korak 1: preštejte pojavitve. ATCG se v ATCGATCGATCG pojavi 3-krat (na mestih 1, 5 in 9).

Korak 2: določite skupno maso DNK. Koncentracija × prostornina = 10 × 20 = 200 ng.

Korak 3: pretvorite v mole. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Delite z (12 baznih parov × 660 g/mol) = 7.920 g/mol. Dobite 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Korak 4: pretvorite v število molekul. Pomnožite z Avogadrovo konstanto: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ molekul/mol ≈ 1,52 × 10¹³ molekul DNK.

Korak 5: pomnožite s številom pojavitev. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³ oziroma približno 45.621.212.121.212 kopij.

To število je videti ogromno, ker vzorec prostornine 20 μL pri 10 ng/μL še vedno vsebuje bilijone kratkih molekul DNK. V resničnih vzorcih se običajno uporabljajo veliko daljše sekvence, zato je pri enaki masi število molekul manjše.

Kje se uporablja analiza števila kopij DNK

Diagnostika raka. Patološki laboratoriji preverjajo število kopij HER2 v tkivu tumorjev dojke. Normalna celica vsebuje dve kopiji. Pomnožen tumor jih lahko vsebuje šest ali več, kar vpliva na upravičenost do ciljnih zdravil, kot je trastuzumab.

Testiranje genetskih bolezni. Bolezni, kot je DiGeorgeov sindrom, vključujejo delecijo dela kromosoma. Downov sindrom vključuje dodatno kopijo kromosoma 21 (trisomija 21). Štetje kopij pomaga potrditi te diagnoze.

Kvantifikacija transgenov in plazmidov. Raziskovalci preverjajo, koliko kopij vstavljenega gena je vstopilo v rastlinsko, živalsko ali bakterijsko celico. Običajno je zaželena ena kopija, saj lahko več kopij sproži utišanje gena v celici.

Spremljanje patogenov in virusne obremenitve. Ocene števila kopij spremljajo količino virusne ali bakterijske DNK v vzorcu, kar se uporablja pri spremljanju okužb in okoljskem testiranju.

Druge metode za merjenje števila kopij

Ta kalkulator omogoča hitro oceno na podlagi podatkov o sekvenci in koncentraciji. Laboratoriji, ki potrebujejo večjo natančnost, običajno uporabijo eno od naslednjih metod:

• Kvantitativna PCR (qPCR): DNK pomnožuje in meri v realnem času; z dobro standardno krivuljo je natančnost približno 15–20%.
• Digitalna PCR (dPCR): vzorec razdeli na tisoče drobnih reakcij za neposredno štetje, brez potrebe po standardni krivulji.
• Fluorescenčna hibridizacija in situ (FISH): sekvence neposredno v celicah ali kromosomih vizualno prešteje pod mikroskopom; v številnih laboratorijih za diagnostiko raka je standardna metoda.
• Sekvenciranje nove generacije (NGS): sekvencira celoten vzorec in hkrati določi profil števila kopij po celotnem genomu.

Pogosta vprašanja

Kaj je število kopij DNK? To je število pojavitev dane sekvence DNK v genomu ali vzorcu. Večina človeških genov se pojavi dvakrat, po enkrat od vsakega starša. Dodatne ali manjkajoče kopije lahko vplivajo na zdravje in tveganje za bolezni.

Kako natančen je ta kalkulator? Kalkulator poda teoretično oceno na podlagi vnesenih podatkov, ne laboratorijske meritve. Natančnost je odvisna od tega, kako natančno je bila izmerjena koncentracija in kako specifična je ciljna sekvenca. Metode, kot je digitalna PCR, so za objavljene rezultate natančnejše.

Ali je ta kalkulator mogoče uporabiti za RNK? Ne. RNK namesto timina uporablja uracil in ima drugačen sladkor, zato se njena relativna molekulska masa razlikuje od DNK. RNK ima povprečno relativno molekulsko maso približno 330 g/mol na nukleotid, v primerjavi s približno 660 g/mol na bazni par DNK. Uporaba formule za DNK pri podatkih o RNK bi dala napačen rezultat.

Zakaj se prekrivajoča se sekvenca šteje več kot enkrat? Kalkulator prešteje vsako mesto, kjer se ciljna sekvenca ujema, tudi če si ujemanja delijo črke. V ATATAT se sekvenca ATA ujema dvakrat, na mestu 1 in mestu 3, ker se vsako začetno mesto preveri neodvisno.

Katero območje koncentracije DNK je najprimernejše? Koncentracije 10–100 ng/μL zagotavljajo najbolj zanesljive meritve na standardnih laboratorijskih instrumentih. Pod 10 ng/μL se merilna napaka poveča, zato je namesto standardnega spektrofotometra priporočljiva občutljivejša metoda, kot je fluorometer.

Ali lahko ta kalkulator oceni število kopij plazmida? Da. Kot sekvenco DNK vnesite celotno sekvenco plazmida, kot ciljno sekvenco pa edinstveno območje inserta; dodajte še izmerjeno koncentracijo plazmida in prostornino vzorca.