Izračunajte precizne zapremine uzoraka na osnovu očitavanja apsorbancije BCA testa i željene mase proteina. Neophodno za dosledno učitavanje proteina u zapadnim blotovima i drugim laboratorijskim primenama.
Ovaj alat izračunava potrebnu zapreminu uzorka na osnovu BCA apsorbancije i mase uzorka. Unesite vrednost apsorbancije i masu uzorka za svaki uzorak da biste izračunali odgovarajuću zapreminu uzorka.
Zapremina uzorka se izračunava koristeći sledeću formulu:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
BCA Kalkulator Zapremine Uzorka Absorbancije je specijalizovani alat dizajniran da pomogne istraživačima i laboratorijskim tehničarima da tačno odrede odgovarajuću zapreminu uzorka za eksperimente na osnovu rezultata BCA (bicinchoninske kiseline) testa. Ovaj kalkulator uzima očitane vrednosti absorbancije iz vašeg BCA testa i vašu željenu masu uzorka kako bi izračunao preciznu zapreminu potrebnu za dosledno učitavanje proteina u aplikacijama kao što su western blotting, enzimski testovi i druge tehnike analize proteina.
BCA test je jedna od najšire korišćenih metoda za kvantifikaciju proteina u laboratorijama za biokemiju i molekularnu biologiju. Merenjem absorbancije vaših uzoraka proteina i poređenjem sa standardnom krivom, možete odrediti koncentraciju proteina sa visokom tačnošću. Naš kalkulator pojednostavljuje ovaj proces automatskim pretvaranjem očitavanja absorbancije u tačne zapremine uzoraka potrebne za vaše eksperimente.
Bicinchoninska kiselina (BCA) test je biohemijska metoda za određivanje ukupne koncentracije proteina u rastvoru. Princip ovog testa se oslanja na formiranje Cu²⁺-proteinskog kompleksa pod alkalnim uslovima, nakon čega dolazi do redukcije Cu²⁺ u Cu¹⁺. Količina redukcije je proporcionalna prisutnom proteinu. BCA formira ljubičasti kompleks sa Cu¹⁺ u alkalnim sredinama, pružajući osnovu za praćenje redukcije bakra od strane proteina.
Intenzitet ljubičaste boje se proporcionalno povećava sa koncentracijom proteina, što se može meriti koristeći spektrofotometar na približno 562 nm. Očitane vrednosti absorbancije se zatim porede sa standardnom krivom kako bi se odredila koncentracija proteina u nepoznatim uzorcima.
Osnovna formula za izračunavanje zapremine uzorka iz rezultata BCA absorbancije je:
Gde:
Koncentracija proteina se izračunava iz očitavanja absorbancije koristeći jednadžbu standardne krive:
Za standardni BCA test, tipični nagib je približno 2.0, a presjek je često blizu nule, iako se ove vrednosti mogu razlikovati u zavisnosti od specifičnih uslova vašeg testa i standardne krive.
Naš kalkulator pojednostavljuje proces određivanja zapremina uzoraka iz rezultata BCA testa. Pratite ove korake da dobijete tačne kalkulacije:
Unesite Informacije o Uzorku:
Izaberite Tip Standardne Krive:
Pogledajte Rezultate:
Kopirajte ili Izvezite Rezultate:
Hajde da prođemo kroz praktičan primer:
To znači da biste trebali učitati 13.33 μL vašeg uzorka da biste dobili 20 μg proteina.
Kalkulator pruža nekoliko važnih informacija:
Koncentracija Proteina: Ovo se izračunava iz vaše očitane vrednosti absorbancije koristeći izabranu standardnu krivu. Predstavlja količinu proteina po jedinici zapremine u vašem uzorku (μg/μL).
Zapremina Uzorka: Ovo je zapremina vašeg uzorka koja sadrži vašu željenu količinu proteina. Ova vrednost je ono što ćete koristiti prilikom pripreme vaših eksperimenata.
Upozorenja i Preporuke: Kalkulator može pružiti upozorenja za:
Jedna od najčešćih aplikacija za ovaj kalkulator je priprema uzoraka za western blotting. Dosledno učitavanje proteina je ključno za pouzdane rezultate western blota, a ovaj kalkulator osigurava da učitate istu količinu proteina za svaki uzorak, čak i kada se njihove koncentracije razlikuju.
Primer radnog toka:
Za enzimske testove, često je potrebno koristiti specifičnu količinu proteina kako bi se standardizovali uslovi reakcije između različitih uzoraka ili eksperimenata.
Primer radnog toka:
U eksperimentima imunoprecipitacije, početak sa doslednom količinom proteina je važan za upoređivanje rezultata između različitih uslova.
Primer radnog toka:
Tokom pročišćavanja proteina, često je potrebno pratiti koncentraciju proteina i izračunati prinos na različitim koracima.
Primer radnog toka:
Dok kalkulator pruža podrazumevane parametre za standardne BCA testove, takođe možete uneti prilagođene vrednosti ako ste generisali svoju standardnu krivu. Ovo je posebno korisno kada:
Da biste koristili prilagođenu standardnu krivu:
Kalkulator vam omogućava da dodate više uzoraka i izračunate njihove zapremine istovremeno. Ovo je posebno korisno prilikom pripreme uzoraka za eksperimente koji zahtevaju dosledno učitavanje proteina između više uslova.
Prednosti obrade u serijama:
Ako je vaša očitana vrednost absorbancije iznad 2.0, može biti van linearne oblasti BCA testa. U takvim slučajevima:
Za očitane vrednosti absorbancije ispod 0.1, možda ste blizu limita detekcije testa, što može uticati na tačnost. Razmotrite:
Ako kalkulator sugeriše zapreminu koja je prevelika za vašu aplikaciju:
Tačna kvantifikacija proteina je bila osnovni zahtev u biokemiji i molekularnoj biologiji od kada su se ova polja pojavila. Rane metode su se oslanjale na određivanje sadržaja azota, što je bilo vremenski zahtevno i zahtevalo specijalizovanu opremu.
Kjeldahlova Metoda (1883): Jedna od najranijih metoda za kvantifikaciju proteina, zasnovana na merenju sadržaja azota.
Biuret Test (Rani 1900-ih): Ova metoda se oslanja na reakciju između peptidnih veza i bakarnih jona u alkalnom rastvoru, proizvodeći ljubičastu boju.
Lowry Test (1951): Razvijen od strane Oliviera Lowryja, ova metoda je kombinovala Biuret reakciju sa Folin-Ciocalteu reagensom, povećavajući osetljivost.
Bradford Test (1976): Marion Bradford je razvila ovu metodu koristeći boju Coomassie Brilliant Blue G-250, koja se vezuje za proteine i pomera maksimum apsorpcije.
BCA Test (1985): Razvijen od strane Paula Smitha i njegovih saradnika u Pierce Chemical Company, ova metoda je kombinovala Biuret reakciju sa BCA detekcijom, nudeći poboljšanu osetljivost i kompatibilnost sa deterdžentima.
BCA test je prvi put opisan u radu iz 1985. godine od strane Smitha i saradnika pod naslovom "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Razvijen je kako bi se adresirali nedostaci postojećih metoda, posebno ometanja od raznih hemikalija koje se često koriste u ekstrakciji i pročišćavanju proteina.
Ključna inovacija je bila korišćenje bicinchoninske kiseline za detekciju Cu¹⁺ jona proizvedenih redukcijom Cu²⁺, formirajući ljubičasti kompleks koji se mogao meriti spektrofotometrijski. Ovo je pružilo nekoliko prednosti:
Od svog uvođenja, BCA test je postao jedna od najšire korišćenih metoda kvantifikacije proteina u laboratorijama za biokemiju i molekularnu biologiju širom sveta.
1=IF(B2<=0,"Greška: Nevažeća absorbancija",IF(C2<=0,"Greška: Nevažeća masa uzorka",C2/(2*B2)))
2
3' Gde:
4' B2 sadrži očitanu vrednost absorbancije
5' C2 sadrži željenu masu uzorka u μg
6' Formula vraća potrebnu zapreminu uzorka u μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Izračunajte koncentraciju proteina iz absorbancije koristeći standardnu krivu."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorbancija ne može biti negativna")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Izračunajte potrebnu zapreminu uzorka na osnovu absorbancije i željene mase."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Masa uzorka mora biti pozitivna")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Izračunata koncentracija proteina mora biti pozitivna")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Primer korišćenja
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Za absorbanciju {absorbance} i željenu masu proteina {sample_mass} μg:")
31 print(f"Koncentracija proteina: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Potrebna zapremina uzorka: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Greška: {e}")
351# Funkcija za izračunavanje koncentracije proteina iz absorbancije
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorbancija ne može biti negativna")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funkcija za izračunavanje zapremine uzorka
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Masa uzorka mora biti pozitivna")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Izračunata koncentracija proteina mora biti pozitivna")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Primer korišćenja
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Za absorbanciju %.2f i željenu masu proteina %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Koncentracija proteina: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Potrebna zapremina uzorka: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Greška: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorbancija ne može biti negativna");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Masa uzorka mora biti pozitivna");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Izračunata koncentracija proteina mora biti pozitivna");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Primer korišćenja
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Za absorbanciju ${absorbance} i željenu masu proteina ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Koncentracija proteina: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Potrebna zapremina uzorka: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Greška: ${error.message}`);
37}
38Odnos između absorbancije i koncentracije proteina je obično linearan unutar određenog opsega. Ispod je vizualizacija standardne BCA krive:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Različite metode kvantifikacije proteina imaju razne prednosti i ograničenja. Evo kako se BCA test upoređuje sa drugim uobičajenim metodama:
| Metoda | Opseg Osetljivosti | Prednosti | Ograničenja | Najbolje za |
|---|---|---|---|---|
| BCA Test | 5-2000 μg/mL | • Kompatibilan sa deterdžentima • Manja varijacija između proteina • Stabilan razvoj boje | • Ometen redukujućim sredstvima • Podložan nekim sredstvima za chelaciju | • Opšta kvantifikacija proteina • Uzorci koji sadrže deterdžente |
| Bradford Test | 1-1500 μg/mL | • Brzo (2-5 min) • Malo ometajućih supstanci | • Visoka varijacija između proteina • Nep kompatibilan sa deterdžentima | • Brza merenja • Uzorci bez deterdženta |
| Lowry Metoda | 1-1500 μg/mL | • Dobro uspostavljena • Dobra osetljivost | • Mnoge ometajuće supstance • Više koraka | • Istorijska doslednost • Čisti uzorci proteina |
| UV Apsorbancija (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Nedestruktivna • Veoma brza • Nema potrebnih reagensa | • Ometena nukleinskim kiselinama • Zahteva čiste uzorke | • Čista rešenja proteina • Brze provere tokom pročišćavanja |
| Fluorometrijska | 0.1-500 μg/mL | • Najveća osetljivost • Širok dinamički opseg | • Skupi reagensi • Zahteva fluorometar | • Veoma razređeni uzorci • Ograničena zapremina uzorka |
BCA (bicinchoninska kiselina) test se prvenstveno koristi za kvantifikaciju ukupne koncentracije proteina u uzorku. Široko se koristi u biokemiji, ćelijskoj biologiji i molekularnoj biologiji za aplikacije kao što su western blotting, enzimski testovi, imunoprecipitacija i pročišćavanje proteina.
BCA test je generalno tačan unutar 5-10% kada se pravilno izvede. Njegova tačnost zavisi od nekoliko faktora uključujući kvalitet standardne krive, odsustvo ometajućih supstanci i da li je sastav nepoznatog proteina sličan standardnom proteinu koji se koristi.
Nekoliko supstanci može ometati rezultate BCA testa, uključujući:
Glavne razlike su:
Ako vaš kalkulator prikazuje veoma veliku zapreminu uzorka, obično to ukazuje na nisku koncentraciju proteina u vašem uzorku. To može biti zbog:
Razmotrite koncentrisanje vašeg uzorka ili prilagođavanje vašeg eksperimentalnog dizajna kako bi se prilagodili nižoj koncentraciji proteina.
Ovaj kalkulator je specifično dizajniran za rezultate BCA testa. Iako se osnovni princip (pretvaranje koncentracije u zapreminu) primenjuje na druge metode, odnos između absorbancije i koncentracije proteina se razlikuje između različitih testova. Za druge metode poput Bradford ili Lowry, trebali biste koristiti različite parametre standardne krive.
Za očitane vrednosti absorbancije van linearne oblasti (tipično >2.0):
Bovini serum albumin (BSA) je najčešće korišćeni standard za BCA testove jer je:
Međutim, ako vaši uzorci sadrže preovlađujući protein koji se značajno razlikuje od BSA, razmotrite korišćenje tog proteina kao vašeg standarda za tačnije rezultate.
Ljubičasta boja koja se razvija u BCA reakciji je stabilna nekoliko sati na sobnoj temperaturi i može se meriti bilo kada unutar tog perioda. Međutim, za najbolje rezultate, preporučuje se merenje svih standarda i uzoraka otprilike u isto vreme nakon razvoja boje.
Iako je tehnički moguće ponovo koristiti standardnu krivu, nije preporučljivo za tačnu kvantifikaciju. Varijacije u reagensima, uslovima inkubacije i kalibraciji instrumenta mogu uticati na odnos između absorbancije i koncentracije proteina. Za pouzdane rezultate, generišite svežu standardnu krivu svaki put kada izvodite test.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Uputstvo. Dostupno na: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Sada kada razumete principe iza BCA kvantifikacije proteina i kalkulacije zapremine uzorka, isprobajte naš kalkulator da pojednostavite svoj laboratorijski rad. Jednostavno unesite svoja očitavanja absorbancije i željenu masu uzorka kako biste dobili trenutne, tačne kalkulacije zapremine uzorka.
Bilo da pripremate uzorke za western blotting, enzimske testove ili bilo koju drugu eksperimentaciju zasnovanu na proteinima, naš kalkulator će pomoći da se osigura doslednost i pouzdanost rezultata. Uštedite vreme, smanjite greške i poboljšajte ponovljivost vaših eksperimenata sa BCA Kalkulatorom Zapremine Uzorka Absorbancije.
Otkrijte više alata koji mogu biti korisni za vaš radni proces