Beräkna PCR-effektivitet från Ct-värden och utspädningsfaktorer. Analysera standardkurvor, bestäm amplifikationseffektivitet och validera dina kvantitativa PCR-experiment.
Värdet måste vara positivt
Värdet måste vara positivt
Värdet måste vara positivt
Värdet måste vara positivt
Värdet måste vara positivt
Ange giltiga data för att generera diagram
qPCR-effektivitet är ett mått på hur väl PCR-reaktionen fungerar. En effektivitet på 100 % betyder att mängden PCR-produkt fördubblas med varje cykel under den exponentiella fasen.
Effektiviteten beräknas från hällningen av standardkurvan, som erhålls genom att plotta Ct-värden mot logaritmen av den initiala mallkoncentrationen (utspädningsserie).
Effektiviteten (E) beräknas med formeln:
E = 10^(-1/slope) - 1
Kvantitativ Polymerase Chain Reaction (qPCR) effektivitet är en kritisk parameter som direkt påverkar noggrannheten och tillförlitligheten i dina qPCR-experiment. qPCR effektivitetsberäknaren hjälper forskare att bestämma hur effektivt deras PCR-reaktioner ampliferar mål-DNA-sekvenser med varje termisk cykel. Idealiska qPCR-reaktioner bör ha en effektivitet mellan 90-110%, vilket indikerar att mängden PCR-produkt ungefär fördubblas med varje cykel under den exponentiella fasen.
Dålig amplifikationseffektivitet kan leda till felaktig kvantifiering, opålitliga resultat och bristande experimentella slutsatser. Genom att beräkna och övervaka din qPCR-effektivitet kan du optimera reaktionsvillkor, validera primerdesigner och säkerställa kvaliteten på dina kvantitativa PCR-data.
Denna beräknare använder standardkurvmetoden, som plottar cykeltröskelvärden (Ct) mot logaritmen av mallkoncentration (representerad av seriella utspädningar), för att bestämma effektiviteten av ditt qPCR-assay. Den resulterande lutningen av denna standardkurva används sedan för att beräkna amplifikationseffektiviteten med en enkel matematisk formel.
Effektiviteten av en qPCR-reaktion beräknas från lutningen av standardkurvan med följande formel:
Där:
För en ideal PCR-reaktion med 100% effektivitet (perfekt fördubbling av ampliconer med varje cykel) skulle lutningen vara -3,32. Detta beror på:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (eller 100%)}
Effektiviteten i procent beräknas genom att multiplicera det decimala värdet av effektiviteten med 100:
\text{Effektivitet (%)} = E \times 100\%
Standardkurvan skapas genom att plotta Ct-värden (y-axel) mot logaritmen av den initiala mallkoncentrationen eller utspädningsfaktorn (x-axel). Förhållandet mellan dessa variabler bör vara linjärt, och kvaliteten på detta linjära förhållande bedöms med hjälp av bestämningskoefficienten (R²).
För tillförlitliga qPCR-effektivitetsberäkningar:
Datapreparation: Beräknaren tar dina Ct-värden för varje utspädningspunkt och utspädningsfaktorn som indata.
Logaritmisk transformation: Utspädningsserien transformeras till en logaritmisk skala (log bas 10).
Linjära regression: Beräknaren utför linjär regressionsanalys på de log-transformerade data för att bestämma lutning, y-intercept och R²-värde.
Effektivitetsberäkning: Med hjälp av lutningsvärdet beräknas effektiviteten med formeln E = 10^(-1/slope) - 1.
Resultattolkning: Beräknaren visar effektiviteten som en procentandel, tillsammans med lutning och R²-värde för att hjälpa dig bedöma tillförlitligheten av ditt qPCR-assay.
Följ dessa steg för att beräkna din qPCR-effektivitet:
Ställ in antalet utspädningar: Välj hur många utspädningspunkter du har i din standardkurva (mellan 3-7 punkter rekommenderas).
Ange utspädningsfaktorn: Ange utspädningsfaktorn som användes mellan på varandra följande prover (t.ex. 10 för en 10-faldig utspädningsserie, 5 för en 5-faldig utspädningsserie).
Ange Ct-värden: Ange Ct-värdena för varje utspädningspunkt. Vanligtvis innehåller den första utspädningen (Utspädning 1) den högsta koncentrationen av mall, vilket resulterar i det lägsta Ct-värdet.
Visa resultat: Beräknaren kommer automatiskt att beräkna och visa:
Tolka resultat: Bedöm om din qPCR-effektivitet ligger inom det acceptabla intervallet (90-110%) och om R²-värdet indikerar en tillförlitlig standardkurva (≥ 0,98).
Kopiera resultat: Använd knappen "Kopiera resultat" för att kopiera alla beräknade värden för dina register eller publikationer.
Låt oss gå igenom ett exempel:
När de plottas på en standardkurva:
Beräknaren kommer att utföra linjär regression och bestämma:
Med hjälp av effektivitetsformeln:
Detta indikerar en bra qPCR-effektivitet på 93%, vilket ligger inom det acceptabla intervallet 90-110%.
Innan du använder ett nytt primerpar för kvantitativa experiment är det viktigt att validera dess prestanda. Att beräkna qPCR-effektivitet hjälper till att:
När nya qPCR-assays utvecklas är effektivitetsberäkningar avgörande för:
I relativa kvantifieringsexperiment är det viktigt att känna till PCR-effektiviteten för:
I kliniska och diagnostiska inställningar är qPCR-effektivitet viktig för:
För miljö- och livsmedelssäkerhetsapplikationer hjälper effektivitetsberäkningar till att:
Även om standardkurvmetoden är den vanligaste metoden för att beräkna qPCR-effektivitet, finns det alternativa metoder:
Denna metod beräknar effektivitet från fluorescensdata av en enda amplifikationskurva, utan att kräva en utspädningsserie. Programvara som LinRegPCR analyserar den exponentiella fasen av individuella reaktioner för att bestämma effektivitet.
Fördelar:
Nackdelar:
Digital PCR (dPCR) ger absolut kvantifiering utan att kräva en standardkurva eller effektivitetsberäkningar.
Fördelar:
Nackdelar:
Viss qPCR-analysprogramvara erbjuder jämförande kvantifieringsmetoder som uppskattar effektivitet utan en fullständig standardkurva.
Fördelar:
Nackdelar:
Utvecklingen av qPCR och effektivitetsberäkningar har utvecklats avsevärt under de senaste decennierna:
Polymerase Chain Reaction (PCR) uppfanns av Kary Mullis 1983, vilket revolutionerade molekylärbiologin. Emellertid var traditionell PCR endast kvalitativ eller semi-kvantitativ. Det första realtids-PCR-systemet utvecklades i början av 1990-talet av Russell Higuchi och kollegor, som visade att övervakning av PCR-produkter när de ackumulerades (med hjälp av etidiumbromidfluorescens) kunde ge kvantitativ information.
I takt med att qPCR-teknologin avancerade insåg forskare vikten av standardisering och validering. Begreppet PCR-effektivitet blev centralt för pålitlig kvantifiering:
Fältet har fortsatt att utvecklas med:
Idag anses beräkning och rapportering av qPCR-effektivitet vara avgörande för publicering av tillförlitliga qPCR-data, och verktyg som denna beräknare hjälper forskare att följa bästa praxis inom området.
1' Excel-formel för att beräkna qPCR-effektivitet från lutning
2' Placera i cell B2 om lutningen finns i cell A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Excel-formel för att konvertera effektivitet till procent
6' Placera i cell C2 om effektiviteten i decimal finns i cell B2
7=B2*100
8
9' Funktion för att beräkna effektivitet från Ct-värden och utspädningsfaktor
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Beräkna linjär regression
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Beräkna lutning
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Beräkna effektivitet
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
331# R-funktion för att beräkna qPCR-effektivitet från Ct-värden och utspädningsfaktor
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Skapa logutspädningsvärden
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Utför linjär regression
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Extrahera lutning och R-kvadrat
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Beräkna effektivitet
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Returnera resultat
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Exempelanvändning
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Effektivitet: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Lutning: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-kvadrat: %.4f\n", results$r_squared))
321import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Beräkna qPCR-effektivitet från Ct-värden och utspädningsfaktor.
8
9 Parametrar:
10 ct_values (list): Lista över Ct-värden
11 dilution_factor (float): Utspädningsfaktor mellan på varandra följande prover
12
13 Returnerar:
14 dict: Ordbok som innehåller effektivitet, lutning, r_squared och intercept
15 """
16 # Skapa logutspädningsvärden
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Utför linjär regression
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Beräkna effektivitet
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Plotta standardkurvan med regressionslinje.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Generera punkter för regressionslinjen
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Utspädning')
48 plt.ylabel('Ct Värde')
49 plt.title('qPCR Standardkurva')
50
51 # Lägg till ekvation och R² till plott
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Effektivitet = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Exempelanvändning
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Effektivitet: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Lutning: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-kvadrat: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Intercept: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Plotta standardkurvan
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
761/**
2 * Beräkna qPCR-effektivitet från Ct-värden och utspädningsfaktor
3 * @param {Array<number>} ctValues - Array av Ct-värden
4 * @param {number} dilutionFactor - Utspädningsfaktor mellan på varandra följande prover
5 * @returns {Object} Objekt som innehåller effektivitet, lutning, rSquared och intercept
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Skapa logutspädningsvärden
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Beräkna medelvärden för linjär regression
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Beräkna lutning och intercept
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Beräkna R-kvadrat
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Beräkna effektivitet
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Exempelanvändning
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Effektivitet: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Lutning: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-kvadrat: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Intercept: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60En bra qPCR-effektivitet ligger typiskt mellan 90% och 110% (0,9-1,1). En effektivitet på 100% representerar perfekt fördubbling av PCR-produkten med varje cykel. Effektiviteter utanför detta intervall kan indikera problem med primerdesign, reaktionsvillkor eller närvaro av hämmare.
Effektiviteter som är större än 100% kan uppstå på grund av:
Ett lågt R²-värde (under 0,98) tyder på dålig linjäritet i din standardkurva, vilket kan orsakas av:
För tillförlitliga effektivitetsberäkningar krävs ett minimum av 3 utspädningspunkter, men 5-6 punkter rekommenderas för mer exakta resultat. Dessa punkter bör täcka hela det dynamiska intervallet av förväntade mallkoncentrationer i dina experimentella prover.
I relativ kvantifiering med ΔΔCt-metoden antas lika effektivitet mellan mål- och referensgener (idealiskt 100%). När effektiviteten skiljer sig avsevärt:
Nej, effektiviteten bör bestämmas för varje primerpar och bör revalideras:
PCR-hämmare kan:
Termerna används ofta omväxlande, men:
För att förbättra qPCR-effektiviteten:
Att jämföra prover med betydligt olika effektivitet rekommenderas inte eftersom:
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
Bio-Rad Laboratories. Real-Time PCR Applications Guide. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
Thermo Fisher Scientific. Real-Time PCR Handbook. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
Vår qPCR Effektivitetsberäknare erbjuder ett enkelt men kraftfullt verktyg för forskare att validera och optimera sina kvantitativa PCR-experiment. Genom att noggrant beräkna effektiviteten från standardkurvor kan du säkerställa pålitlig kvantifiering, felsöka problematiska assays och följa bästa praxis inom qPCR-experimentering.
Prova vår beräknare idag för att förbättra kvaliteten och tillförlitligheten i dina qPCR-data!
Upptäck fler verktyg som kan vara användbara för din arbetsflöde