Kalibreringskretsberäknare | Linjär regression för laboratorieanalys

Vad är en kalkylator för kalibreringskurvor?

En kalkylator för kalibreringskurvor omvandlar instrumentavläsningar till koncentrationer. Det gör den genom att anpassa en rät linje till datapunkter från standarder med känd koncentration och sedan använda linjen för att omvandla en ny avläsning till en koncentration. Laboratorier använder kalibreringskurvor inom kemi, biologi och miljöanalys när ett instrument rapporterar en signal, till exempel absorbans eller topparea, i stället för en koncentration direkt.

Kalkylatorn på den här sidan anpassar en linje med linjär regression, enligt minsta kvadratmetoden. Den rapporterar lutningen, interceptet och R², som är ett mått på hur nära punkterna följer linjen. Därefter kan den uppskatta koncentrationen hos ett okänt prov utifrån en uppmätt respons.

Formeln för kalibreringskurvan

En kalibreringskurva förutsätter ett linjärt samband mellan koncentration och instrumentrespons:

$y = mx + b$

• $y$ är responsen (det som instrumentet mäter)
• $x$ är koncentrationen
• $m$ är lutningen
• $b$ är y-axelns skärning

Så beräknas lutningen och interceptet

För en uppsättning med $n$ punkter är lutningen och interceptet som bäst passar data (enligt minsta kvadratmetoden):

$m = \frac{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})(y_i - \bar{y})}{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})^2}$

$b = \bar{y} - m\bar{x}$

Här är $\bar{x}$ och $\bar{y}$ medelkoncentrationen respektive medelresponsen för alla punkter.

Formeln för R²

R², determinationskoefficienten, visar hur väl linjen passar data:

$R^2 = 1 - \frac{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \hat{y}_i)^2}{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \bar{y})^2}$

$\hat{y}_i$ är den respons som linjen förutsäger för varje $x_i$. R² sträcker sig från 0 till 1. Ett värde på 1 betyder att varje punkt ligger exakt på linjen.

Formel för okänd koncentration

När lutningen och interceptet är kända kan en uppmätt respons $y$ omvandlas tillbaka till en koncentration:

$x = \frac{y - b}{m}$

Om denna beräkning ger ett negativt tal rapporterar kalkylatorn koncentrationen som 0, eftersom en negativ koncentration inte är fysikaliskt meningsfull. Den rapporterar också 0 när den anpassade lutningen är 0, eftersom en horisontell linje inte innehåller någon information om koncentrationen.

Räkneexempel

Anta att fyra standarder ger följande resultat:

Medelkoncentrationen är 3 och medelresponsen är 0,20.

Lutning:

$m = \frac{(-3)(-0.15) + (-1)(-0.05) + (1)(0.04) + (3)(0.16)}{(-3)^2 + (-1)^2 + 1^2 + 3^2} = \frac{1.02}{20} = 0.0510$

Intercept:

$b = 0.20 - (0.0510)(3) = 0.0470$

R²: en jämförelse mellan de förutsagda och de faktiska responserna ger R² = 0,9966.

Den anpassade linjen är:

$y = 0.0510x + 0.0470 \quad (R^2 = 0.9966)$

Anta nu att ett okänt prov ger en respons på 0,20. Dess koncentration är:

$x = \frac{0.20 - 0.0470}{0.0510} = 3.0000$

Så använder du kalkylatorn

1. Ange varje standards kända koncentration och uppmätta respons som ett talpar. Kalkylatorn börjar med två rader.
2. Välj ”Lägg till datapunkt” för att ange fler standarder eller ”Ta bort datapunkt” bredvid en rad för att ta bort den. Minst två punkter krävs.
3. När minst två punkter har fyllts i visar kalkylatorn regressionsekvationen, R²-värdet och en graf över punkterna med den anpassade linjen. Lutningen, interceptet, R² och koncentrationen avrundas till fyra decimaler vid visningen.
4. Ange en uppmätt respons under ”Beräkna okänd koncentration” för att se motsvarande koncentration. Värdet uppdateras automatiskt medan det skrivs in; det finns ingen separat knapp att trycka på.
5. Välj ”Återställ” för att rensa alla angivna punkter och responsfältet och börja om.

Tolkning av lutning, intercept och R²

Lutningen visar hur mycket responsen förändras per koncentrationsenhet. En större lutning innebär att metoden reagerar starkt på små koncentrationsförändringar.

Interceptet är den förutsagda responsen vid nollkoncentration. Det återspeglar bakgrundssignalen, till exempel från ett blankprov eller instrumentets baslinje. Ett intercept som inte är noll är vanligt och behöver inte vara ett problem, men ett stort eller varierande intercept mellan kalibreringar kan tyda på kontaminering eller ett instrumentfel.

R² visar hur nära punkterna följer en rät linje. Värden över 0,99 är typiska för en välfungerande linjär metod. Ett lägre R² kan bero på pipetteringsfel, en försämrad standard eller ett koncentrationsintervall där responsen inte längre är linjär.

Var kalibreringskurvor används

Kalibreringskurvor är vanliga överallt där ett instruments råsignal behöver omvandlas till en koncentration:

• Spektrofotometri — ljusets absorbans mäts och omvandlas till koncentration, till exempel vid mätning av protein- eller pigmenthalt.
• Kromatografi (HPLC, GC) — topparean eller topphöjden från ett kromatogram omvandlas till koncentration, vilket är vanligt vid drogtester och miljöanalyser.
• ELISA och andra immunologiska analyser — färgintensitet eller fluorescensintensitet från en mikroplattsläsare omvandlas till antigen- eller antikroppskoncentration.
• qPCR — tröskelcykelvärden från serieutspädningar av ett prov med känd koncentration bildar en kurva som används för att uppskatta mängden genetiskt material i ett okänt prov.

När en rät linje inte passar

Vissa metoder är inte linjära över hela sitt mätområde. Vanliga åtgärder är att begränsa kalibreringen till ett smalare, linjärt område, tillämpa en logaritmisk transformation före linjeanpassningen, använda en polynomanpassning (en böjd kurva) eller använda viktad regression när mätfelet ökar eller minskar med koncentrationen. Den här kalkylatorn anpassar endast en rät linje. Om punkterna tydligt bildar en kurva blir resultaten mindre tillförlitliga, och en annan modell kan behövas.

Vanliga frågor och svar

Vad är en kalibreringskurva?

En kalibreringskurva är en linje som anpassats till instrumentavläsningar för prover med känd koncentration. Den används för att omvandla en ny avläsning från ett prov med okänd koncentration till ett koncentrationsvärde.

Hur många datapunkter behöver en kalibreringskurva?

Kalkylatorn behöver minst två punkter för att anpassa en linje, men två punkter kan inte visa om det verkliga sambandet faktiskt är rätlinjigt. De flesta laboratorier använder fem till åtta standarder som täcker det förväntade intervallet för de okända proverna.

Vad betyder R² i en kalibreringskurva?

R² mäter hur nära datapunkterna följer den anpassade linjen, på en skala från 0 till 1. Ett värde på 1 betyder att varje punkt ligger exakt på linjen. Värden över 0,99 betraktas i allmänhet som starka belägg för ett linjärt samband.

Kan koncentrationer uppskattas utanför standardernas intervall?

Det är osäkert att uppskatta en koncentration under den lägsta standarden eller över den högsta standarden, eftersom det saknas data som bekräftar att linjen förblir rät där. Det är bättre att späda ett prov som ger en för hög avläsning eller koncentrera ett som ger en för låg avläsning och mäta om inom det kalibrerade intervallet.

Varför visas den beräknade koncentrationen ibland som 0?

Om en uppmätt respons är lägre än det anpassade interceptet (vid positiv lutning) ger formeln $x = (y - b) / m$ ett negativt tal. Kalkylatorn visar då 0, eftersom en verklig koncentration inte kan vara negativ. Den visar också 0 när lutningen är 0, vilket inträffar om alla standarder har samma respons eller alla standarder har samma koncentration.

Vad är skillnaden mellan lutningen och interceptet?

Lutningen beskriver hur känslig responsen är för en förändring i koncentrationen. Interceptet är den respons som förutsägs vid nollkoncentration och återspeglar ofta bakgrundssignalen snarare än själva analyten.