เครื่องคำนวณความเข้มข้นโปรตีน | A280 เป็น mg/mL

เครื่องคำนวณความเข้มข้นของโปรตีน

เครื่องคำนวณความเข้มข้นของโปรตีนจะแปลงค่าการดูดกลืนแสงที่อ่านจากสเปกโตรโฟโตมิเตอร์เป็นปริมาณโปรตีนที่ละลายอยู่ในสารละลาย โดยทั่วไปจะแสดงผลเป็นมิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร (mg/mL) หรือไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร (μg/mL) การคำนวณนี้อาศัยกฎของเบียร์–แลมเบิร์ต ซึ่งเป็นความสัมพันธ์ทางเคมีที่เชื่อมโยงปริมาณแสงที่ตัวอย่างดูดกลืนกับปริมาณสารที่ตัวอย่างมีอยู่

การวัดความเข้มข้นของโปรตีน

โปรตีนส่วนใหญ่ดูดกลืนแสงอัลตราไวโอเลตได้มากที่ความยาวคลื่น 280 นาโนเมตร (nm) การดูดกลืนนี้เกิดจากกรดอะมิโนสองชนิดเป็นหลัก ได้แก่ ทริปโตเฟนและไทโรซีน ซึ่งอยู่ในโครงสร้างของโปรตีน สเปกโตรโฟโตมิเตอร์จะฉายแสงผ่านตัวอย่างและวัดปริมาณแสงที่ตัวอย่างดูดกลืน ค่าที่อ่านได้นี้เรียกว่าค่าการดูดกลืนแสง หรือ A280 เมื่อวัดที่ 280 nm

การวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 280 nm ทำได้รวดเร็วและไม่ทำลายตัวอย่าง จึงแตกต่างจากวิธีทางเคมี เช่น การทดสอบแบรดฟอร์ดหรือ BCA ที่อธิบายไว้ด้านล่าง วิธีนี้เหมาะที่สุดกับโปรตีนบริสุทธิ์ในสารละลาย โดยมีค่าการดูดกลืนแสงอยู่ระหว่างประมาณ 0.1 ถึง 1.0 ค่าที่อยู่นอกช่วงนี้มีความน่าเชื่อถือน้อยกว่า ดังนั้นจึงมักต้องเจือจางตัวอย่างก่อนการวัด

สูตรคำนวณความเข้มข้นของโปรตีน

เครื่องคำนวณจะจัดรูปกฎของเบียร์–แลมเบิร์ตใหม่เพื่อหาความเข้มข้น:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — ความเข้มข้นของโปรตีน หน่วยเป็น mg/mL
• A — ค่าการดูดกลืนแสงที่ 280 nm (เป็นตัวเลขไม่มีหน่วย)
• DF — ตัวคูณการเจือจาง หรือจำนวนเท่าที่ตัวอย่างเดิมถูกเจือจางก่อนนำไปวัด
• ε — สัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงจำเพาะ ค่าคงที่เฉพาะของโปรตีน มีหน่วยเป็น L/(g·cm)
• l — ระยะทางที่แสงเดินทางผ่านตัวอย่าง มีหน่วยเป็น cm (โดยปกติคือ 1 ซม. ในคิวเวตมาตรฐาน ซึ่งเป็นภาชนะขนาดเล็กที่ทำจากแก้วหรือพลาสติกและใช้ในสเปกโตรโฟโตมิเตอร์)

หากต้องการแปลงผลลัพธ์เป็นไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ให้คูณค่าที่เป็น mg/mL ด้วย 1,000 หากต้องการหามวลรวมของโปรตีนในตัวอย่าง ให้คูณความเข้มข้นด้วยปริมาตรของตัวอย่างในหน่วยมิลลิลิตร

ตัวอย่างพร้อมวิธีทำ

ตัวอย่างให้ค่าการดูดกลืนแสงเท่ากับ 0.5 ที่ 280 nm ตัวอย่างนี้ไม่ได้เจือจาง ดังนั้นตัวคูณการเจือจางจึงเท่ากับ 1 และวัดในคิวเวตมาตรฐานขนาด 1 ซม. โปรตีนคือซีรัมอัลบูมินจากวัว (BSA) ซึ่งมีสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงเท่ากับ 0.667 ล./(g·cm)

C = (0.5 × 1) / (0.667 × 1) ≈ 0.75 mg/mL

ในตัวอย่างปริมาตร 1 มล. ค่านี้เท่ากับโปรตีนรวมประมาณ 0.75 mg หรือ 750 μg/mL

สัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงของโปรตีนทั่วไป

โปรตีนแต่ละชนิดดูดกลืนแสงแตกต่างกัน เนื่องจากมีจำนวนกรดอะมิโนตกค้างของทริปโตเฟนและไทโรซีนไม่เท่ากัน สัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงอธิบายคุณสมบัตินี้สำหรับโปรตีนชนิดหนึ่งที่ 280 นาโนเมตร โดยมีหน่วยเป็น L/(g·cm) ค่าที่ใช้กันทั่วไป ได้แก่:

เครื่องคำนวณยังรองรับสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงที่กำหนดเองสำหรับโปรตีนที่ไม่อยู่ในรายการนี้ สำหรับโปรตีนที่ทราบลำดับกรดอะมิโน สามารถประมาณค่านี้ได้ด้วยสูตรที่ Gill และ von Hippel เผยแพร่ใน 1989: ε₂₈₀ = (กรดอะมิโนตกค้างของทริปโตเฟน × 5,500) + (กรดอะมิโนตกค้างของไทโรซีน × 1,490) + (กรดอะมิโนตกค้างของไซสทีน × 125) สูตรนี้ให้ผลลัพธ์เป็น M⁻¹cm⁻¹ ซึ่งเป็นหน่วยโมลาร์และแตกต่างจากค่าที่อิงมวลในหน่วย L/(g·cm) ข้างต้น เครื่องมือฟรี เช่น ProtParam ซึ่งให้บริการโดยเซิร์ฟเวอร์ ExPASy สามารถคำนวณค่านี้โดยตรงจากลำดับโปรตีน

ระยะทางที่แสงเดินทางผ่านตัวอย่างและตัวคูณการเจือจาง

ระยะทางที่แสงเดินทางผ่านตัวอย่างคือความกว้างของคิวเวตที่บรรจุตัวอย่าง โดยวัดเป็นเซนติเมตร คิวเวตมาตรฐานมีความกว้าง 1 ซม. สเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบไมโครวอลุ่มซึ่งใช้วัดตัวอย่างปริมาณน้อยมาก อาจใช้ระยะทางที่สั้นกว่ามาก เช่น 0.1 ซม.

ตัวคูณการเจือจางใช้คำนึงถึงการเจือจางที่ทำก่อนการวัด หากตัวอย่างเข้มข้นให้ค่าการดูดกลืนแสงสูงกว่า 1.0 มักจะเจือจางด้วยบัฟเฟอร์ก่อน ตัวคูณการเจือจางเท่ากับปริมาตรรวมหลังการเจือจางหารด้วยปริมาตรตัวอย่างเดิม ตัวอย่างเช่น การผสมตัวอย่าง 10 μL กับบัฟเฟอร์ 990 μL จะได้ปริมาตรรวม 1,000 μL และมีตัวคูณการเจือจางเท่ากับ 100

วิธีอื่นในการวัดความเข้มข้นของโปรตีน

การวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 280 nm เป็นหนึ่งในวิธีมาตรฐานหลายวิธีที่ใช้ในห้องปฏิบัติการ

• การทดสอบแบรดฟอร์ด: ใช้สีย้อมที่เปลี่ยนสีเมื่อจับกับโปรตีน วิธีนี้ใช้ได้ดีกับตัวอย่างที่ยังไม่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์ แต่การเปลี่ยนสีอาจแตกต่างกันระหว่างโปรตีนแต่ละชนิด
• การทดสอบ BCA: อาศัยการเปลี่ยนสีที่เกิดจากพันธะเพปไทด์ของโปรตีน ใช้ร่วมกับสารซักฟอกได้หลายชนิด แต่ใช้เวลาทำนานกว่าการอ่านค่าการดูดกลืนแสงโดยตรง
• วิธี Lowry: เป็นวิธีเก่าที่มีความไวสูงมาก แต่ทำปฏิกิริยาได้ไม่ดีกับองค์ประกอบทั่วไปบางชนิดของบัฟเฟอร์

วิธีทั้งสามนี้ทำลายตัวอย่าง การวัด A280 โดยตรงไม่ทำลายตัวอย่าง จึงสามารถเก็บตัวอย่างเดิมกลับมาใช้ได้อีก

คำถามที่พบบ่อย

ช่วงค่าการดูดกลืนแสงที่เหมาะสมสำหรับวิธีนี้คือเท่าใด?

อยู่ระหว่าง 0.1 ถึง 1.0 ต่ำกว่า 0.1 ค่าที่อ่านได้จะไม่แม่นยำ สูงกว่า 1.0 ความสัมพันธ์ระหว่างค่าการดูดกลืนแสงกับความเข้มข้นอาจไม่เป็นเส้นตรงอีกต่อไป จึงควรเจือจางตัวอย่างก่อน

เหตุใดจึงวัดที่ 280 nm แทนที่จะเป็น 260 nm?

กรดนิวคลีอิก เช่น DNA และ RNA ดูดกลืนแสงได้มากที่ 260 nm ส่วนโปรตีนดูดกลืนแสงได้มากกว่าที่ 280 nm เนื่องจากมีทริปโตเฟนและไทโรซีนอยู่ การวัดที่ 280 nm ช่วยลดการรบกวนจากกรดนิวคลีอิกที่อาจมีอยู่ในตัวอย่าง

จะหาสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงของโปรตีนที่ไม่อยู่ในรายการได้อย่างไร?

สำหรับโปรตีนที่ทราบลำดับ เครื่องมืออย่าง ProtParam จะคำนวณจากจำนวนหมู่ตกค้างของทริปโตเฟน ไทโรซีน และไซสทีน นอกจากนี้ยังสามารถวัดโดยตรงได้ด้วยการเปรียบเทียบค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่างกับสารละลายที่ทราบความเข้มข้น

วิธีนี้ใช้กับส่วนผสมของโปรตีนได้หรือไม่?

วิธีนี้เหมาะที่สุดกับโปรตีนบริสุทธิ์ชนิดเดียวที่ทราบสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสง ส่วนผสมของโปรตีนที่ไม่ทราบชนิด เช่น ไลเซตของเซลล์ มักวัดด้วยการทดสอบแบรดฟอร์ดหรือ BCA แทน เนื่องจากวิธีเหล่านั้นให้ค่าประมาณโปรตีนรวมที่สม่ำเสมอกว่า

สารซักฟอกสามารถรบกวนการอ่านค่าได้หรือไม่?

ได้ สารซักฟอกหลายชนิดดูดกลืนแสงใกล้ 280 นาโนเมตร ซึ่งอาจทำให้ผลลัพธ์คลาดเคลื่อน การใช้ตัวอย่างเปล่าที่มีสารซักฟอกความเข้มข้นเดียวกันจะช่วยหักล้างค่าการดูดกลืนแสงพื้นหลังนั้นได้ หากสารซักฟอกมีความเข้มข้นสูงมาก อาจต้องใช้การทดสอบที่เข้ากันได้กับสารซักฟอก เช่น BCA แทน