เครื่องคำนวณความเข้มข้นของ DNA | เครื่องแปลง A260 เป็น ng/μL

เครื่องคำนวณความเข้มข้นของ DNA

เครื่องคำนวณความเข้มข้นของ DNA แปลงค่าการดูดกลืนแสง UV ที่ 260 นาโนเมตร ซึ่งเรียกว่า A260 ให้เป็นความเข้มข้นของ DNA หน่วยนาโนกรัมต่อไมโครลิตร (ng/µL) นอกจากนี้ยังรายงานปริมาณ DNA ทั้งหมดในตัวอย่างเป็นไมโครกรัม (µg)

การดูดกลืนแสง A260 คืออะไร?

A260 คือปริมาณแสงอัลตราไวโอเลตที่สารละลายดูดกลืนที่ความยาวคลื่น 260 นาโนเมตร DNA ดูดกลืนแสง UV ได้มากที่สุดใกล้ความยาวคลื่นนี้เนื่องจากเบสของนิวคลีโอไทด์ เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์วัดค่า A260 หลังจากวัดแบลงก์ โดยใช้บัฟเฟอร์เดียวกับตัวอย่างเพื่อหักลบการดูดกลืนแสงพื้นหลัง ยิ่งมี DNA ในสารละลายมาก ค่า A260 ที่วัดได้ก็ยิ่งสูง

สูตรคำนวณความเข้มข้นของ DNA

DNA สายคู่ดูดกลืนแสง UV แปรผันตามความเข้มข้น ซึ่งเป็นความสัมพันธ์ที่เรียกว่ากฎเบียร์–แลมเบิร์ต ในเส้นทางแสงมาตรฐานยาว 1 เซนติเมตร สารละลายที่มีค่า A260 เท่ากับ 1.0 จะมี DNA สายคู่ประมาณ 50 ng/µL ค่านี้คือแฟกเตอร์การแปลง ซึ่งใช้แปลงค่า A260 ใด ๆ เป็นความเข้มข้นได้ดังนี้:

ความเข้มข้น DNA (ng/µL) = A260 × 50 × แฟกเตอร์การเจือจาง

แฟกเตอร์การเจือจางจะคำนึงถึงการเจือจางใด ๆ ที่ทำก่อนวัดตัวอย่าง ตัวอย่างที่วัดโดยไม่เจือจางมีแฟกเตอร์การเจือจางเท่ากับ 1

วิธีคำนวณผลได้รวมของ DNA

เมื่อทราบความเข้มข้นแล้ว สามารถหามวลรวมของ DNA ในตัวอย่างได้จากปริมาตรของตัวอย่าง:

DNA ทั้งหมด (µg) = ความเข้มข้น (ng/µL) × ปริมาตร (µL) ÷ 1000

วิธีคำนวณความเข้มข้นของ DNA ทีละขั้นตอน

1. ผสมตัวอย่างให้ทั่วถึงก่อนวัด DNA อาจเกาะอยู่ที่ผนังหลอดหรือตกตะกอนไม่สม่ำเสมอ
2. เจือจางตัวอย่างหากมีความเข้มข้นสูงมาก โดยตั้งเป้าให้ค่า A260 อยู่ระหว่าง 0.1 ถึง 1.0 ค่าที่อ่านจากเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์จะมีความน่าเชื่อถือน้อยที่สุดเมื่ออยู่นอกช่วงนี้
3. ทำแบลงก์เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ด้วยบัฟเฟอร์เดียวกับที่ใช้เจือจาง จากนั้นวัดตัวอย่างที่ 260 นาโนเมตร
4. ป้อนค่า A260 ปริมาตรตัวอย่าง และแฟกเตอร์การเจือจางลงในเครื่องคำนวณเพื่อหาความเข้มข้นและผลได้รวม ช่องกรอกทั้งสามช่องต้องกรอกข้อมูลให้ครบ และปริมาตรต้องมากกว่าศูนย์ จึงจะแสดงผลลัพธ์

ตัวอย่างการคำนวณ

ตัวอย่าง 1: ตัวอย่างที่ไม่เจือจาง

ค่า A260 เท่ากับ 0.5 ไม่เจือจาง (แฟกเตอร์การเจือจาง 1) และมีปริมาตรตัวอย่าง 100 µL

• ความเข้มข้น = 0.5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
• DNA ทั้งหมด = 25 × 100 ÷ 1000 = 2.5 µg

ตัวอย่าง 2: ตัวอย่างที่เจือจาง

หลอดหนึ่งมี DNA บริสุทธิ์ปริมาตร 50 µL ส่วนเล็ก ๆ ของตัวอย่างถูกเจือจาง 10 เท่า และส่วนที่เจือจางมีค่า A260 เท่ากับ 0.75 แฟกเตอร์การเจือจางใช้แปลงค่าดังกล่าวกลับเป็นความเข้มข้นในหลอดเดิม และ 50 µL คือปริมาตรที่ป้อนในขั้นตอนคำนวณผลได้รวม

• ความเข้มข้น = 0.75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
• DNA ทั้งหมด = 375 × 50 ÷ 1000 = 18.75 µg

การคำนวณแฟกเตอร์การเจือจาง

แฟกเตอร์การเจือจาง = ปริมาตรรวมหลังเจือจาง ÷ ปริมาตรของตัวอย่างเดิม

การเติมสารละลาย DNA 5 µL ลงในบัฟเฟอร์ 45 µL ทำให้มีปริมาตรรวม 50 µL ดังนั้นแฟกเตอร์การเจือจางคือ 50 ÷ 5 = 10 ตัวอย่างที่ไม่ได้เจือจางมีแฟกเตอร์การเจือจางเท่ากับ 1

ช่วงความเข้มข้นของ DNA โดยทั่วไป

ความเข้มข้นขึ้นอยู่กับชนิดของตัวอย่างและวิธีการสกัด การสกัด DNA จีโนมโดยทั่วไปให้ค่าประมาณระหว่าง 10 ถึง 100 ng/µL การเตรียม DNA พลาสมิดมักให้ความเข้มข้นสูงกว่า ซึ่งบางครั้งสูงถึงหลายร้อย ng/µL ผลลัพธ์ที่อยู่นอกช่วงที่คาดหมายของวิธีนั้นมากอาจชี้ว่ามีปัญหาในการสกัดหรือการวัด

ข้อจำกัดของการวัดการดูดกลืนแสง UV

การวัด A260 ทำได้รวดเร็ว แต่ไม่ใช่วิธีที่ไวหรือจำเพาะที่สุดสำหรับ DNA โปรตีน RNA และส่วนประกอบของบัฟเฟอร์บางชนิดก็ดูดกลืนแสงใกล้ 260 นาโนเมตร และอาจทำให้ค่าที่อ่านได้สูงเกินจริง นักวิทยาศาสตร์มักตรวจสอบอัตราส่วน A260/A280 ควบคู่กับความเข้มข้นเพื่อคัดกรองการปนเปื้อนของโปรตีน โดยทั่วไปอัตราส่วนใกล้ 1.8 บ่งชี้ว่าตัวอย่าง DNA บริสุทธิ์ วิธีที่ใช้สีย้อมเรืองแสง เช่น การทดสอบ Qubit จะจับเฉพาะ DNA สายคู่และให้ค่าที่แม่นยำกว่าเมื่อใช้กับตัวอย่างเจือจางหรือไม่บริสุทธิ์ แต่ต้องใช้น้ำยาเพิ่มเติมและเครื่องฟลูออโรมิเตอร์

คำถามที่พบบ่อย

คำนวณความเข้มข้นของ DNA จาก A260 อย่างไร?

คูณค่า A260 ด้วย 50 ซึ่งเป็นแฟกเตอร์การแปลงมาตรฐานสำหรับ DNA สายคู่ จากนั้นคูณด้วยแฟกเตอร์การเจือจาง หากตัวอย่างไม่ได้เจือจาง ให้ใช้แฟกเตอร์การเจือจางเท่ากับ 1

อัตราส่วน A260/A280 ที่ดีคือเท่าใด?

อัตราส่วนใกล้ 1.8 โดยทั่วไปบ่งชี้ว่าตัวอย่าง DNA บริสุทธิ์ อัตราส่วนที่ต่ำกว่านั้นบ่งชี้การปนเปื้อนของโปรตีน อัตราส่วนที่สูงกว่า 2.0 อาจบ่งชี้การปนเปื้อนของ RNA

เครื่องคำนวณนี้ใช้กับ RNA ได้หรือไม่?

ใช้โดยตรงไม่ได้ เพราะ RNA ใช้แฟกเตอร์การแปลง 40 ng/µL แทน 50 หากต้องการประมาณความเข้มข้นของ RNA ให้คูณผลลัพธ์จากเครื่องคำนวณด้วย 0.8 (40 ÷ 50) หรือใช้ A260 × 40 × แฟกเตอร์การเจือจางโดยตรง

เหตุใดค่า A260 จึงควรอยู่ระหว่าง 0.1 ถึง 1.0?

การดูดกลืนแสงยังคงแปรผันตามความเข้มข้นโดยประมาณตามกฎเบียร์–แลมเบิร์ต โดยเฉพาะภายในช่วงนี้ นอกช่วงดังกล่าวค่าที่อ่านได้จะมีความน่าเชื่อถือน้อยลง ดังนั้นตัวอย่างที่เข้มข้นหรือเจือจางเกินไปควรเจือจางหรือทำให้เข้มข้นขึ้นก่อนวัดซ้ำ

ความแตกต่างระหว่างความเข้มข้นกับความบริสุทธิ์คืออะไร?

ความเข้มข้นวัดว่ามี DNA อยู่มากเพียงใด โดยมีหน่วยเป็น ng/µL ส่วนความบริสุทธิ์วัดว่าตัวอย่างสะอาดเพียงใด โดยพิจารณาจากอัตราส่วนการดูดกลืนแสง เช่น A260/A280 เป็นหลัก ตัวอย่างอาจมีความเข้มข้นสูงแต่ยังไม่บริสุทธิ์ หรือมีความเข้มข้นต่ำแต่บริสุทธิ์มาก

แปลง ng/µL เป็น µg/mL อย่างไร?

หน่วยทั้งสองมีค่าเท่ากันในเชิงตัวเลข 1 ng/µL เท่ากับ 1 µg/mL เพราะหน่วยมวลและหน่วยปริมาตรต่างก็เปลี่ยนสเกลด้วยแฟกเตอร์ 1000

เอกสารอ้างอิง

1. แซมบรูค, เจ. และ รัสเซลล์, ดี. ดับเบิลยู. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (ฉบับที่ 3). สำนักพิมพ์ Cold Spring Harbor Laboratory
2. แกลลาเกอร์, เอส. อาร์. และ เดส์ฌาร์แดงส์, พี. อาร์. (2006). การหาปริมาณ DNA และ RNA ด้วยสเปกโทรสโกปีการดูดกลืนแสงและการเรืองแสง Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
3. แมนเชสเตอร์, เค. แอล. (1995). คุณค่าของอัตราส่วน A260/A280 สำหรับการวัดความบริสุทธิ์ของกรดนิวคลีอิก BioTechniques, 19(2), 208–210