เครื่องคำนวณกฎของเบียร์-แลมเบิร์ต - คำนวณการดูดกลืนแสงทันที

กฎเบียร์–แลมเบิร์ตคืออะไร?

กฎเบียร์–แลมเบิร์ตเป็นสูตรที่อธิบายว่าสารละลายดูดกลืนแสงมากน้อยเพียงใด สูตรนี้เชื่อมโยงค่าการดูดกลืนแสงกับสามปัจจัย ได้แก่ ความเข้มข้นของสารละลาย ความสามารถของสารที่ละลายอยู่ในการดูดกลืนแสง และระยะทางที่แสงเดินทางผ่านตัวอย่าง กฎนี้เรียกอีกอย่างว่ากฎของเบียร์ เครื่องคำนวณกฎเบียร์–แลมเบิร์ตใช้สูตรนี้เพื่อหาค่าการดูดกลืนแสง ค่าการส่งผ่านแสง และเปอร์เซ็นต์ของแสงที่ถูกดูดกลืนจากข้อมูลนำเข้าเพียงไม่กี่ค่า

กฎนี้เป็นเครื่องมือพื้นฐานในสเปกโทรสโกปี ซึ่งเป็นการศึกษาว่าสสารดูดกลืนและปล่อยแสงอย่างไร มีการใช้กฎนี้เป็นประจำในห้องปฏิบัติการเคมี ชีววิทยา และการแพทย์ เพื่อวัดความเข้มข้นของสารในสารละลาย

สูตรของกฎเบียร์–แลมเบิร์ต

กฎเบียร์–แลมเบิร์ตระบุว่า:

$A = \varepsilon \times c \times l$

• A คือค่าการดูดกลืนแสง หรือปริมาณแสงที่สารละลายดูดกลืนที่ความยาวคลื่นหนึ่ง ๆ ค่านี้ไม่มีหน่วย
• ε (เอปไซลอน) คือค่าการดูดกลืนแสงเชิงโมล หรือเรียกอีกอย่างว่าสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงเชิงโมล ใช้วัดว่าสารดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นจำเพาะได้มากเพียงใด หน่วยคือ L/(mol·cm)
• c คือความเข้มข้นของสาร มีหน่วยเป็น mol/L (โมลาริตี)
• l คือความยาวทางเดินแสง หรือระยะทางที่แสงเดินทางผ่านตัวอย่าง มีหน่วยเป็น cm

ค่าการดูดกลืนแสงสัมพันธ์กับค่าการส่งผ่านแสง ซึ่งเป็นสัดส่วนของแสงที่ผ่านตัวอย่าง:

$A = -\log_{10}(T)$

$T = 10^{-A}$

ในที่นี้ T คือค่าการส่งผ่านแสง ซึ่งเป็นตัวเลขระหว่าง 0 ถึง 1 การคูณ T ด้วย 100 จะได้เปอร์เซ็นต์ของแสงที่ส่งผ่าน ส่วนเปอร์เซ็นต์ของแสงที่ถูกดูดกลืนคือ:

$\text{เปอร์เซ็นต์การดูดกลืนแสง} = (1 - T) \times 100\%$

ตัวอย่างเช่น ค่าการดูดกลืนแสง 1.0 หมายถึง T = 0.1 ดังนั้นแสง 90% จึงถูกดูดกลืน ค่าการดูดกลืนแสง 2.0 หมายถึง T = 0.01 ดังนั้นแสง 99% จึงถูกดูดกลืน

วิธีคำนวณค่าการดูดกลืนแสง

หากต้องการหาค่าการดูดกลืนแสงด้วยเครื่องคำนวณ ให้ป้อนค่าสามค่า:

1. ความยาวทางเดินแสง (l) — ความกว้างของภาชนะบรรจุตัวอย่าง ซึ่งโดยปกติเป็นคิวเวต คิวเวตมาตรฐานส่วนใหญ่กว้าง 1 ซม. แต่คิวเวตเฉพาะทางบางชนิดกว้าง 0.1 ซม. หรือ 10 ซม.
2. ค่าการดูดกลืนแสงเชิงโมล (ε) — สมบัติเฉพาะของสารแต่ละชนิดที่ความยาวคลื่นหนึ่ง ๆ โดยทั่วไปค้นค่าได้จากตารางอ้างอิงที่ตีพิมพ์ไว้ หรือคำนวณจากโครงสร้างของโมเลกุล ตัวอย่างเช่น โปรตีนดูดกลืนแสงบริเวณ 280 nm เนื่องจากกรดแอมิโนสองชนิดคือทริปโตเฟนและไทโรซีน และค่าที่แน่นอนขึ้นอยู่กับว่าโปรตีนนั้นมีกรดแอมิโนเหล่านี้อยู่กี่หน่วย
3. ความเข้มข้น (c) — ปริมาณสารที่ละลายอยู่ มีหน่วยเป็น mol/L ความเข้มข้นที่ระบุด้วยหน่วยอื่น เช่น mg/mL ต้องแปลงหน่วยก่อนโดยใช้มวลโมลาร์ของโมเลกุล

เครื่องคำนวณจะคูณตัวเลขทั้งสามค่าเข้าด้วยกันเพื่อหาค่าการดูดกลืนแสง จากนั้นคำนวณค่าการส่งผ่านแสงและเปอร์เซ็นต์การดูดกลืนแสงจากผลลัพธ์ดังกล่าว

ตัวอย่างการคำนวณ

นักวิจัยทำโปรตีนให้บริสุทธิ์และต้องตรวจสอบความเข้มข้นก่อนทำการทดลอง ค่าการดูดกลืนแสงเชิงโมลของโปรตีนที่ 280 nm ทราบได้จากลำดับของโปรตีน: ε = 44,000 ล./(mol·cm) นักวิจัยวัดตัวอย่างในคิวเวตมาตรฐานขนาด 1 ซม. และอ่านค่าการดูดกลืนแสงได้ A = 0.523

จัดรูปสมการใหม่เพื่อแก้หาความเข้มข้น:

$c = \frac{A}{\varepsilon \times l} = \frac{0.523}{44{,}000 \times 1} = 1.19 \times 10^{-5} \text{ mol/L}$

ซึ่งเท่ากับ 11.9 ไมโครโมลาร์ (μM) ค่านี้อยู่ในช่วงที่เครื่องมือให้ผลการอ่านได้แม่นยำที่สุด นักวิจัยจึงเชื่อถือค่าดังกล่าวได้โดยไม่ต้องเจือจางตัวอย่างเพิ่มเติม

การแปลความหมายของค่าการดูดกลืนแสง

• A = 0: ไม่มีการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นนี้
• A = 0.3 ถึง 0.9: ช่วงที่เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ส่วนใหญ่ให้ค่าการอ่านที่แม่นยำและเป็นเชิงเส้นมากที่สุด
• A = 1.0: แสงถูกดูดกลืน 90% และส่งผ่าน 10%
• A = 2.0: แสงถูกดูดกลืน 99% และส่งผ่าน 1%
• A มากกว่า 2.5: อยู่นอกช่วงที่เครื่องมือส่วนใหญ่ให้ผลเชื่อถือได้ ควรเจือจางตัวอย่างแล้ววัดซ้ำ

ค่าที่อ่านได้ต่ำกว่าประมาณ 0.3 ได้รับผลกระทบจากสัญญาณรบกวนของเครื่องมือ ส่วนค่าที่อ่านได้สูงกว่าประมาณ 1.5 ได้รับผลกระทบจากแสงรั่วปริมาณเล็กน้อยภายในเครื่องมือ ซึ่งทำให้เกิดความคลาดเคลื่อน การเจือจางตัวอย่างแล้ววัดซ้ำเป็นวิธีมาตรฐานเมื่อค่าที่อ่านได้นอกช่วงที่แม่นยำ

การใช้งานกฎเบียร์–แลมเบิร์ต

เคมีวิเคราะห์ ห้องปฏิบัติการวัดค่าการดูดกลืนแสงของตัวอย่าง แล้วใช้สูตรคำนวณย้อนกลับเพื่อหาความเข้มข้นที่ไม่ทราบค่า วิธีนี้ใช้กันทั่วไปในการตรวจวัดระดับไนเตรต ฟอสเฟต และไอออนโลหะในน้ำ รวมถึงตรวจสอบความเข้มข้นของสารเคมีแต่ละรุ่นระหว่างการผลิต

ชีวเคมี ค่าการดูดกลืนแสงที่ 280 nm ใช้ประมาณความเข้มข้นของโปรตีน ค่าการดูดกลืนแสงที่ 260 nm ใช้ประมาณความเข้มข้นของ DNA หรือ RNA โดยตามธรรมเนียม ค่าการดูดกลืนแสง 1.0 สอดคล้องกับ DNA สายคู่ประมาณ 50 μg/mL หรือ RNA 40 μg/mL อัตราส่วนของค่าการอ่านทั้งสองค่า (A260/A280) ใช้ประเมินความบริสุทธิ์ของตัวอย่างได้คร่าว ๆ

เภสัชภัณฑ์ ผู้ผลิตยาใช้ค่าการดูดกลืนแสงเพื่อตรวจสอบว่าเม็ดยาปลดปล่อยสารออกฤทธิ์ได้เร็วเพียงใด และติดตามการเสื่อมสลายของยาในระหว่างการเก็บรักษา

การแพทย์ เครื่องตรวจเลือดอัตโนมัติจำนวนมากวัดค่าการดูดกลืนแสงจากปฏิกิริยาเคมีที่ทำให้สีเปลี่ยน เพื่อรายงานระดับกลูโคส เอนไซม์ตับ และบิลิรูบิน

อาหารและเครื่องดื่ม สีของเบียร์วัดจากค่าการดูดกลืนแสงที่ 430 nm ตามวิธีของอนุสัญญาผู้ผลิตเบียร์แห่งยุโรป (EBC) วิธีที่คล้ายกันนี้ใช้ตรวจสีของไวน์และเครื่องดื่มไม่มีแอลกอฮอล์

ข้อจำกัดของกฎเบียร์–แลมเบิร์ต

กฎนี้ตั้งอยู่บนสมมติฐานว่าแสงมีความยาวคลื่นเดียวที่แน่นอน และตัวอย่างไม่ทำให้แสงกระเจิง กฎจะใช้ไม่ได้ในสถานการณ์ทั่วไปบางประการ:

• ความเข้มข้นสูง เมื่อสูงกว่าประมาณ 0.01 mol/L โมเลกุลที่ละลายอยู่จะเริ่มมีปฏิสัมพันธ์กัน และค่าการดูดกลืนแสงจะไม่เพิ่มขึ้นเป็นเส้นตรงตามความเข้มข้นอีกต่อไป
• ตัวอย่างขุ่นหรือมีอนุภาคจำนวนมาก สารแขวนลอยและของเหลวขุ่นทำให้แสงกระเจิงนอกเหนือจากการดูดกลืนแสง ส่งผลให้ค่าการดูดกลืนแสงที่อ่านได้สูงเกินจริง กฎเบียร์–แลมเบิร์ตไม่ได้คำนึงถึงการกระเจิง แบบจำลองที่เกี่ยวข้องซึ่งเรียกว่าทฤษฎีคูเบลกา–มังก์ใช้กับตัวอย่างทึบแสงหรือทำให้แสงกระเจิง เช่น ผง
• การเปลี่ยนแปลงทางเคมีระหว่างการวัด สารบางชนิดสลายตัวเมื่อได้รับแสง หรือเปลี่ยนแปลงตามค่า pH ระหว่างการวัด ทำให้ค่าการอ่านเปลี่ยนไปในระหว่างการวัด
• การเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิ ค่าการดูดกลืนแสงเชิงโมลขึ้นอยู่กับอุณหภูมิ ดังนั้นค่าที่วัดได้ที่อุณหภูมิไม่สม่ำเสมอกันจึงไม่สามารถนำมาเปรียบเทียบโดยตรงได้

ประวัติ

กฎนี้พัฒนาขึ้นตลอดเวลากว่าหนึ่งศตวรรษจากผลงานของนักวิทยาศาสตร์สามคน ปิแอร์ บูแฌ อธิบายใน 1729 ว่าแต่ละชั้นที่มีความหนาเท่ากันของวัสดุจะดูดกลืนแสงที่ผ่านชั้นนั้นในสัดส่วนเท่ากัน โยฮันน์ ไฮน์ริช ลัมแบร์ทนำความสัมพันธ์นี้มาเขียนใหม่ในรูปแบบคณิตศาสตร์ในหนังสือ Photometria ของเขาใน 1760 โดยแสดงให้เห็นว่าค่าการดูดกลืนแสงเพิ่มขึ้นแปรผันตรงกับความยาวทางเดินแสง ออกุสต์ เบียร์ขยายกฎนี้ใน 1852 เพื่อแสดงให้เห็นว่าค่าการดูดกลืนแสงยังเพิ่มขึ้นแปรผันตรงกับความเข้มข้น กฎรวมนี้บางครั้งเรียกว่ากฎบูแฌ–เบียร์–แลมเบิร์ต เพื่อยกย่องนักวิทยาศาสตร์ทั้งสามคน

คำถามที่พบบ่อย

กฎเบียร์–แลมเบิร์ตใช้ทำอะไร กฎนี้คำนวณว่าสารละลายดูดกลืนแสงมากเพียงใด และใช้คำนวณย้อนกลับเพื่อหาความเข้มข้นที่ไม่ทราบค่าจากค่าการดูดกลืนแสงที่วัดได้ จึงเป็นพื้นฐานของสเปกโทรโฟโตเมทรีแบบยูวี–วิส ซึ่งเป็นเทคนิคในห้องปฏิบัติการที่ใช้กันทั่วไปเพื่อวัดปริมาณสารในสารละลาย

กฎเบียร์–แลมเบิร์ตใช้หน่วยอะไร ความยาวทางเดินแสงใช้หน่วยเซนติเมตร ค่าการดูดกลืนแสงเชิงโมลใช้หน่วย L/(mol·cm) และความเข้มข้นใช้หน่วย mol/L ค่าการดูดกลืนแสงเองไม่มีหน่วย แม้บางครั้งจะระบุเป็น "AU" ซึ่งหมายถึงหน่วยการดูดกลืนแสง การนำหน่วยอื่นมาใช้ในสูตรโดยไม่แปลงหน่วยก่อนจะทำให้ได้คำตอบผิด

เหตุใดค่าการดูดกลืนแสงที่อ่านได้จึงไม่แปรผันตามความเข้มข้น สาเหตุที่พบบ่อยที่สุดคือความเข้มข้นสูงกว่าประมาณ 0.01 mol/L ตัวอย่างขุ่นหรือมีอนุภาคจำนวนมาก หรือค่าที่อ่านได้อยู่นอกช่วง 0.3–0.9 มาก ซึ่งเป็นช่วงที่เครื่องมือให้ผลแม่นยำที่สุด การเจือจางตัวอย่างแล้ววัดซ้ำมักช่วยยืนยันได้ว่าสาเหตุใดเป็นสาเหตุที่เกิดขึ้น

ค่าการดูดกลืนแสงกับค่าการส่งผ่านแสงแตกต่างกันอย่างไร ค่าการส่งผ่านแสงคือสัดส่วนของแสงที่ผ่านตัวอย่าง ส่วนค่าการดูดกลืนแสงคือลอการิทึมติดลบฐาน 10ของค่าการส่งผ่านแสง: A = −log₁₀(T) เมื่อค่าการดูดกลืนแสงเพิ่มขึ้น ค่าการส่งผ่านแสงจะลดลง

ค่าการดูดกลืนแสงกับความหนาแน่นเชิงแสงแตกต่างกันอย่างไร เป็นปริมาณเดียวกัน คำว่า "ความหนาแน่นเชิงแสง" มักใช้ในชีววิทยามากกว่า ส่วน "ค่าการดูดกลืนแสง" พบได้บ่อยกว่าในเคมี

ช่วงค่าการดูดกลืนแสงใดแม่นยำที่สุด ประมาณ 0.3 ถึง 0.9 ต่ำกว่าช่วงนี้สัญญาณรบกวนของเครื่องมือจะครอบงำสัญญาณ สูงกว่าประมาณ 1.5 แสงรั่วภายในเครื่องมือจะทำให้เกิดความคลาดเคลื่อน และสูงกว่าประมาณ 2.5 เครื่องมือส่วนใหญ่จะไม่สามารถให้ค่าการอ่านที่เชื่อถือได้

เอกสารอ้างอิง

1. เบียร์, A. (1852). "Bestimmung der Absorption des rothen Lichts in farbigen Flüssigkeiten." Annalen der Physik und Chemie, 86: 78–88.
2. Swinehart, D. F. (1962). "The Beer-Lambert Law." Journal of Chemical Education, 39(7): 333–335.
3. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., & Popp, J. (2020). "The Bouguer-Beer-Lambert Law: Shining Light on the Obscure." ChemPhysChem, 21(18): 2029–2046.