เครื่องคำนวณน้ำหนักโมเลกุลโปรตีน | เครื่องมือคำนวณ MW ฟรี

เครื่องคำนวณน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีน

เครื่องคำนวณน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนใช้หามวลของโปรตีนจากลำดับกรดอะมิโน ผลลัพธ์แสดงเป็นดาลตัน (Da) ซึ่งเป็นหน่วยมาตรฐานของมวลโมเลกุล หนึ่งดาลตันมีค่าใกล้เคียงกับมวลของอะตอมไฮโดรเจนหนึ่งอะตอม

น้ำหนักโมเลกุลมีความสำคัญในการทำงานห้องปฏิบัติการในชีวิตประจำวัน ช่วยให้นักวิจัยเลือกเปอร์เซ็นต์เจลสำหรับ SDS-PAGE เลือกคอลัมน์สำหรับการกรองด้วยเจล และตรวจสอบว่าผลแมสสเปกโทรเมทรีสอดคล้องกับโปรตีนที่คาดไว้หรือไม่ ค่าที่เครื่องคำนวณให้เป็นน้ำหนักเชิงทฤษฎีที่อิงจากลำดับเท่านั้น โปรตีนจริงอาจมีน้ำหนักมากกว่าเนื่องจากการเติมหมู่เคมีหลังจากการสร้างโปรตีน ซึ่งเรียกว่าการดัดแปลงหลังการแปลรหัส การดัดแปลงเหล่านี้มีตั้งแต่ไม่กี่ดาลตันสำหรับหมู่ฟอสเฟตหนึ่งหมู่ ไปจนถึงหลายหมื่นดาลตันสำหรับสายโซ่น้ำตาลขนาดใหญ่

วิธีคำนวณน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีน

สูตร

$MW_{protein} = \sum_{i=1}^{n} MW_{residue_i} + MW_{water}$

กรดอะมิโนแต่ละตัวในสายโซ่จะมีส่วนเป็น น้ำหนักของเรซิดิว ไม่ใช่น้ำหนักของกรดอะมิโนอิสระ เมื่อกรดอะมิโนสองตัวเชื่อมกันด้วยพันธะเพปไทด์ ปฏิกิริยาจะปล่อยน้ำหนึ่งโมเลกุลออกมา น้ำหนักของเรซิดิวได้หักน้ำดังกล่าวออกไว้แล้ว ดังนั้นผลรวมตามลำดับจึงคำนึงถึงพันธะเพปไทด์ภายในทั้งหมดโดยอัตโนมัติ

หลังจากรวมมวลของเรซิดิวแล้ว ให้เติมน้ำหนึ่งโมเลกุลกลับเข้าไป (18.010565 Da) ซึ่งครอบคลุมปลายอิสระทั้งสองของสายโซ่ ได้แก่ อะตอมไฮโดรเจนที่จุดเริ่มต้น (ปลาย N) และหมู่ไฮดรอกซิลที่ปลายสาย (ปลาย C)

ข้อผิดพลาดที่พบบ่อยคือการหักน้ำออกสำหรับพันธะเพปไทด์แต่ละพันธะ แล้วจึงเติมน้ำหนึ่งโมเลกุลกลับแยกต่างหาก วิธีนี้นับการสูญเสียน้ำซ้ำสองครั้ง เพราะน้ำถูกหักออกจากน้ำหนักของเรซิดิวด้านล่างไว้แล้ว ในการคำนวณจึงมีพจน์น้ำเพียงรายการเดียว คือปริมาณน้ำหนึ่งโมเลกุลที่เติมกลับในตอนท้าย

น้ำหนักของเรซิดิวกรดอะมิโน

ต่อไปนี้คือมวลของเรซิดิวแบบโมโนไอโซโทปในหน่วยดาลตัน สำหรับกรดอะมิโนมาตรฐาน 20 ชนิด:

ตัวอย่างพร้อมวิธีทำ

พิจารณาสายโซ่สั้น ๆ อะลานีน-ไกลซีน-ซีรีน ซึ่งเขียนเป็น AGS

1. รวมค่าน้ำหนักของเรซิดิว: 71.03711 + 57.02146 + 87.03203 = 215.0906 Da
2. เติมน้ำหนึ่งโมเลกุลสำหรับปลายสายโซ่ทั้งสองด้าน: 215.0906 + 18.010565 = 233.101165 Da
3. เมื่อปัดเป็นทศนิยมสองตำแหน่ง น้ำหนักโมเลกุลของ AGS คือ 233.10 Da

ไม่ต้องหักน้ำเพิ่มสำหรับพันธะเพปไทด์สองพันธะในไตรเพปไทด์นี้ การสูญเสียดังกล่าวรวมอยู่ในน้ำหนักของเรซิดิวทั้งสามตัวที่ใช้ในขั้นตอน 1 แล้ว

วิธีใช้เครื่องคำนวณน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีน

1. ป้อนลำดับโดยใช้รหัสกรดอะมิโนมาตรฐานแบบอักษรเดียว เช่น MVKMDVYKGSSIGDSMSRSM ใช้ได้ทั้งตัวพิมพ์ใหญ่และตัวพิมพ์เล็ก
2. เครื่องคำนวณจะตรวจสอบลำดับขณะพิมพ์ และแจ้งอักขระใด ๆ ที่ไม่ใช่หนึ่งในรหัสมาตรฐาน 20 รหัส
3. เครื่องจะแสดงน้ำหนักโมเลกุลเป็นดาลตัน ความยาวลำดับ และรายละเอียดองค์ประกอบของกรดอะมิโน
4. คัดลอกผลลัพธ์ได้ในคลิกเดียวสำหรับสมุดบันทึกห้องปฏิบัติการหรือรายงาน

ก่อนวางลำดับจากฐานข้อมูล เช่น UniProt ให้ลบบรรทัดส่วนหัว FASTA (บรรทัดที่ขึ้นต้นด้วย >) และหมายเลขตำแหน่งใด ๆ จากซอฟต์แวร์จัดเรียงลำดับออก ตัวอักษร X, B, Z และ J ไม่ใช่รหัสกรดอะมิโนมาตรฐานและจะถูกปฏิเสธ ควรแทนที่ด้วยกรดอะมิโนที่ระบุแน่ชัดก่อนคำนวณ

เหตุใดน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนจึงมีความสำคัญ

• อิเล็กโทรโฟเรซิสของเจล (SDS-PAGE): โปรตีนขนาดเล็กที่ต่ำกว่า 20 kDa ต้องใช้เจลที่มีเปอร์เซ็นต์สูงกว่าเพื่อให้แยกได้ดี ส่วนโปรตีนขนาดใหญ่ที่มากกว่า 100 kDa ต้องใช้เจลที่มีเปอร์เซ็นต์ต่ำกว่า
• การกรองด้วยเจล: ช่วงน้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนเป็นตัวกำหนดว่าควรใช้เรซินในคอลัมน์ชนิดใดจึงจะแยกโปรตีนได้อย่างเหมาะสม
• แมสสเปกโทรเมทรี: นำน้ำหนักที่คำนวณได้ไปเปรียบเทียบกับน้ำหนักที่วัดได้ เพื่อยืนยันอัตลักษณ์หรือตรวจหาการเปลี่ยนแปลงที่ไม่คาดคิด
• การสังเคราะห์เพปไทด์: น้ำหนักโมเลกุลใช้กำหนดปริมาณสารตั้งต้นที่ต้องใช้ในการจับคู่แต่ละขั้นอย่างแม่นยำ
• การคำนวณบัฟเฟอร์และขนาดยา: การแปลงระหว่างโมลาริตีกับความเข้มข้นตามมวลจำเป็นต้องใช้น้ำหนักโมเลกุล

ข้อจำกัด

เครื่องคำนวณให้น้ำหนักเชิงทฤษฎีที่อิงจากลำดับเท่านั้น โดยไม่รวม:

• การดัดแปลงหลังการแปลรหัส เช่น สายโซ่น้ำตาลที่เติมระหว่างกระบวนการไกลโคซิเลชัน หรือหมู่ฟอสเฟตที่เติมระหว่างกระบวนการฟอสโฟรีเลชัน สิ่งเหล่านี้ต้องเติมด้วยตนเองหรือวัดด้วยแมสสเปกโทรเมทรี
• พันธะไดซัลไฟด์ พันธะแต่ละพันธะระหว่างเรซิดิวซิสเทอีนสองตัวจะทำให้อะตอมไฮโดรเจนหายไปสองอะตอม หรือประมาณ 2.02 Da ต่อพันธะ เครื่องคำนวณถือว่าซิสเทอีนทั้งหมดไม่มีพันธะ
• กรดอะมิโนที่ไม่ใช่มาตรฐาน เช่น ซีลีโนซิสเทอีนหรือไพโรไลซีน และเรซิดิวที่ถูกดัดแปลงทางเคมี เช่น ไฮดรอกซีโพรลีน
• โคแฟกเตอร์ เช่น หมู่ฮีมหรือไอออนโลหะที่จับอยู่กับโปรตีน

คำถามที่พบบ่อย

น้ำหนักโมเลกุลของโปรตีนคืออะไร คือน้ำหนักรวมของโปรตีน ซึ่งโดยทั่วไปแสดงเป็นดาลตัน (Da) หรือกิโลดาลตัน (kDa) โดย 1 kDa เท่ากับ 1,000 Da มีค่าเท่ากับผลรวมของน้ำหนักเรซิดิวกรดอะมิโนในลำดับ บวกกับน้ำหนึ่งโมเลกุลสำหรับปลายสายโซ่ทั้งสองด้าน

เหตุใดสูตรจึงเติมน้ำแทนที่จะหักน้ำออก การสร้างพันธะเพปไทด์ปล่อยน้ำหนึ่งโมเลกุลออกมา และน้ำหนักของเรซิดิวที่ใช้ในการรวมได้หักน้ำดังกล่าวออกแล้ว จึงเติมน้ำหนึ่งโมเลกุลกลับในตอนท้ายเท่านั้น เพื่อรวมไฮโดรเจนและหมู่ไฮดรอกซิลอิสระที่ปลายทั้งสองของสายโซ่ที่สร้างเสร็จแล้ว

น้ำหนักที่คำนวณได้แม่นยำเพียงใด สำหรับโปรตีนที่ไม่มีการดัดแปลงทางเคมี การคำนวณมีความแม่นยำตามความละเอียดของมวลกรดอะมิโนที่ใช้ โดยทั่วไปคลาดเคลื่อนไม่ถึงหนึ่งดาลตัน โปรตีนจริงที่มีการดัดแปลง เช่น ไกลโคซิเลชันหรือพันธะไดซัลไฟด์ จะมีน้ำหนักแตกต่างจากค่าที่คำนวณได้

เครื่องคำนวณรองรับกรดอะมิโนที่ถูกดัดแปลงหรือไม่ใช่มาตรฐานหรือไม่ ไม่รองรับ เครื่องรองรับเฉพาะกรดอะมิโนมาตรฐาน 20 ชนิดเท่านั้น ซีลีโนซิสเทอีน ไพโรไลซีน และเรซิดิวที่ถูกดัดแปลงชนิดอื่น ๆ จะไม่ถูกรู้จำ และต้องจัดการด้วยการแก้ไขด้วยตนเองหรือใช้เครื่องมือเฉพาะทาง

จะแปลงดาลตันเป็นกิโลดาลตันได้อย่างไร หารด้วย 1,000 โปรตีนที่มีน้ำหนัก 25,000 Da จะเท่ากับ 25 kDa งานวิจัยมักใช้ Da สำหรับเพปไทด์ขนาดเล็ก และ kDa สำหรับโปรตีนขนาดใหญ่

เหตุใดผลเจลหรือแมสสเปกของฉันจึงไม่ตรงกับน้ำหนักที่คำนวณได้ สาเหตุที่พบบ่อยที่สุดคือการดัดแปลงหลังการแปลรหัส พันธะไดซัลไฟด์ หรือโปรตีนที่ถูกตัดให้สั้นลงเป็นรูปแบบสุกที่สั้นกว่าหลังการแปลรหัส อีกสาเหตุหนึ่งคือชนิดของมวลไม่ตรงกัน เครื่องคำนวณนี้รายงานมวลแบบโมโนไอโซโทป ซึ่งใช้ไอโซโทปที่มีมวลน้อยที่สุดของแต่ละอะตอม เครื่องมืออื่นอีกหลายชนิด รวมถึง ExPASy ProtParam รายงานมวลเฉลี่ยแทน มวลเฉลี่ยจะสูงกว่า โดยต่ำกว่า 1 Da สำหรับเพปไทด์สั้น และสูงกว่าหลายสิบดาลตันสำหรับโปรตีนขนาดใหญ่ นอกจากนี้ SDS-PAGE อาจแสดงแถบในตำแหน่งที่ทำให้เข้าใจผิดสำหรับโปรตีนที่เป็นกรดหรือเบสมาก จึงเป็นเพียงค่าประมาณคร่าว ๆ ของน้ำหนักโมเลกุล