เครื่องคำนวณความละลายของโปรตีน - เครื่องมือฟรีสำหรับค่าพีเอชและอุณหภูมิ

เครื่องคำนวณการละลายของโปรตีนใช้ประมาณความเข้มข้นสูงสุดของโปรตีนที่ยังคงละลายอยู่ในตัวทำละลายภายใต้ค่า pH อุณหภูมิ และความแรงไอออนิกที่กำหนด โดยแปลงเคมีพื้นฐานให้เป็นตัวเลขเดียวในหน่วยมิลลิกรัมของโปรตีนต่อตัวทำละลายหนึ่งมิลลิลิตร

การละลายของโปรตีนมีความสำคัญในชีวเคมี การพัฒนาตำรับยา และวิทยาศาสตร์การอาหาร โปรตีนที่ไม่คงสภาพละลายจะเกิดการรวมตัวหรือการตกตะกอน ซึ่งอาจทำให้การทดลองเสียหายหรือทำให้ยาไม่สามารถฉีดได้

วิธีคำนวณการละลายของโปรตีน

การละลายขึ้นอยู่กับห้าปัจจัย ได้แก่ จุดไอโซอิเล็กทริกของโปรตีน (ค่า pH ที่ประจุสุทธิเป็นศูนย์) จุดหลอมเหลวของโปรตีน (อุณหภูมิที่โปรตีนเริ่มคลายโครงสร้าง) ค่าคงที่ไดอิเล็กทริกของตัวทำละลาย (ค่าที่บอกความสามารถในการแยกอนุภาคมีประจุ) ค่า pH ของสารละลาย และความแรงไอออนิก (ค่าที่บอกปริมาณเกลือที่ละลายอยู่)

เครื่องคำนวณเริ่มจากค่าการละลายของโปรตีนแต่ละชนิดในน้ำภายใต้สภาวะอ้างอิงที่ทราบ ได้แก่ 25 °C, pH 7.0 และความแรงไอออนิก 0.15 M (ใกล้เคียงระดับเกลือในเลือด) จากนั้นคูณค่าดังกล่าวด้วยอัตราส่วนสี่ค่า ค่าอัตราส่วนละหนึ่งค่าต่อสภาวะที่เปลี่ยนแปลง

สูตรการละลายของโปรตีน

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ คือค่าการละลายของโปรตีนในน้ำภายใต้สภาวะอ้างอิงที่ทราบ มีหน่วยเป็น mg/mL
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$ โดย $pI$ คือจุดไอโซอิเล็กทริกของโปรตีน การละลายต่ำที่สุดที่จุดไอโซอิเล็กทริก และเพิ่มขึ้นเมื่อค่า pH เคลื่อนห่างจากจุดดังกล่าว ก่อนจะคงที่ภายในช่วงประมาณสองหน่วย pH
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$ โดย $I$ คือความแรงไอออนิกในหน่วยโมลต่อลิตร เมื่อระดับเกลือต่ำ พจน์นี้จะเพิ่มการละลายเล็กน้อย (“การเพิ่มการละลายด้วยเกลือ”) เมื่อระดับเกลือสูง พจน์นี้จะลดการละลาย (“การลดการละลายด้วยเกลือ”)
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$ โดย $T_m$ คือจุดหลอมเหลวของโปรตีนในหน่วย °C การละลายจะเพิ่มขึ้นอย่างช้า ๆ ตามอุณหภูมิ จากนั้นลดลงอย่างรวดเร็วเมื่ออุณหภูมิใกล้ $T_m$ และโปรตีนเริ่มคลายโครงสร้าง
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$ โดย $\varepsilon$ คือค่าคงที่ไดอิเล็กทริกของตัวทำละลาย น้ำมีค่าคงที่ไดอิเล็กทริกเท่ากับ 78.4 ดังนั้นพจน์นี้จึงเท่ากับ 1 ในน้ำ ตัวทำละลายที่แยกประจุได้มีประสิทธิภาพน้อยกว่าน้ำ เช่น เอทานอล จะลดการละลาย

ค่าอ้างอิงที่เครื่องคำนวณใช้

ประเภทการละลาย

ตัวอย่าง: อัลบูมินในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต

จงหาการละลายของอัลบูมินในบัฟเฟอร์ฟอสเฟตที่ 25 °C, pH 7.4 และความแรงไอออนิก 0.15 M

ค่าอ้างอิงของอัลบูมินคือ $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/mL และ $T_m = 63°C$ บัฟเฟอร์ฟอสเฟตมีค่าคงที่ไดอิเล็กทริกเท่ากับ 76.0

1. พจน์ pH: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$ และ $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$ อัตราส่วน: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$
2. พจน์ไอออนิก: ความแรงไอออนิก (0.15 M) เท่ากับค่าอ้างอิง ดังนั้นอัตราส่วนคือ 1
3. พจน์อุณหภูมิ: อุณหภูมิ (25 °C) เท่ากับค่าอ้างอิง ดังนั้นอัตราส่วนคือ 1
4. พจน์ตัวทำละลาย: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/mL}$

เครื่องคำนวณรายงานค่า 492.12 mg/mL ซึ่งอยู่ในประเภท “ละลายได้สูงมาก”

ตัวอย่าง: ไลโซไซม์ในกลีเซอรอลที่อุณหภูมิต่ำ

จงหาการละลายของไลโซไซม์ในสารละลายกลีเซอรอลที่ 4 °C, pH 5.0 และความแรงไอออนิก 0.1 M สภาวะเหล่านี้คล้ายกับการเก็บเอนไซม์ในที่เย็น

ค่าอ้างอิงของไลโซไซม์คือ $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/mL และ $T_m = 72°C$ กลีเซอรอลมีค่าคงที่ไดอิเล็กทริกเท่ากับ 42.5

1. พจน์ pH: การเปลี่ยนจาก pH 7.0 เป็น pH 5.0 (ทั้งสองค่าต่ำกว่าจุด pI 11.35 มาก) ทำให้พจน์ pH เปลี่ยนแปลงเพียงเล็กน้อย อัตราส่วน: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$
2. พจน์ไอออนิก: การลดความแรงไอออนิกจาก 0.15 M เป็น 0.1 M เพิ่มการละลายเล็กน้อยผ่านผลของการเพิ่มการละลายด้วยเกลือ อัตราส่วน: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$
3. พจน์อุณหภูมิ: การทำให้เย็นลงจาก 25 °C เป็น 4 °C ซึ่งต่ำกว่าจุดหลอมเหลวมาก จะทำให้พจน์ดังกล่าวลดลง อัตราส่วน: 0.8106
4. พจน์ตัวทำละลาย: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/mL}$

เครื่องคำนวณรายงานค่า 35.88 mg/mL ซึ่งอยู่ในประเภท “ละลายได้” ค่าคงที่ไดอิเล็กทริกต่ำของกลีเซอรอล ไม่ใช่อุณหภูมิต่ำ เป็นปัจจัยที่ดึงผลลัพธ์ลงจากค่าอ้างอิง

วิธีใช้เครื่องคำนวณการละลายของโปรตีน

1. เลือกโปรตีนจากรายการ ได้แก่ อัลบูมิน อินซูลิน ไลโซไซม์ ฮีโมโกลบิน ไมโอโกลบิน คอลลาเจน เคซีน หรือไฟบริโนเจน
2. เลือกตัวทำละลาย ได้แก่ น้ำ บัฟเฟอร์ฟอสเฟต บัฟเฟอร์ทริส กลีเซอรอล DMSO เมทานอล เอทานอล หรืออะซีโตน
3. ป้อนอุณหภูมิในหน่วย °C (0 ถึง 100) ค่า pH (0 ถึง 14) และความแรงไอออนิกในหน่วยโมลาร์ (0 ถึง 2)
4. อ่านค่าการละลายที่คำนวณได้ในหน่วย mg/mL และประเภทของการละลาย แถบด้านล่างผลลัพธ์จะแสดงค่าบนมาตราส่วน 0 ถึง 100 mg/mL และจะแสดงเต็มที่ 100 mg/mL หรือสูงกว่า

ปัจจัยที่มีผลต่อการละลายของโปรตีน

pH และจุดไอโซอิเล็กทริก โปรตีนทุกชนิดมีจุดไอโซอิเล็กทริก ซึ่งเป็นค่า pH ที่พื้นผิวของโปรตีนไม่มีประจุไฟฟ้าสุทธิ ที่ค่า pH นี้ โมเลกุลโปรตีนจะไม่ผลักกัน จึงจับกลุ่มและหลุดออกจากสารละลายได้ง่ายขึ้น การทำให้ค่า pH ห่างจากจุดไอโซอิเล็กทริกไม่ว่าจะในทิศทางใด จะทำให้โปรตีนมีประจุสุทธิ โมเลกุลที่มีประจุจะผลักกัน ทำให้ยังแยกออกจากกันและคงสภาพละลายอยู่

ความแรงไอออนิก ไอออนของเกลือที่ละลายอยู่จะล้อมรอบหมู่ที่มีประจุบนพื้นผิวโปรตีน ที่ความเข้มข้นต่ำถึงปานกลาง ไอออนเหล่านี้จะบังประจุซึ่งมิฉะนั้นจะดึงดูดให้โมเลกุลโปรตีนสองโมเลกุลเข้าหากัน ส่งผลให้การละลายเพิ่มขึ้น เรียกปรากฏการณ์นี้ว่าการเพิ่มการละลายด้วยเกลือ ที่ความเข้มข้นเกลือสูง ไอออนจะแย่งโมเลกุลน้ำกับโปรตีน ทำให้ชั้นน้ำที่ช่วยให้โปรตีนละลายอยู่หลุดออกไป เรียกปรากฏการณ์นี้ว่าการลดการละลายด้วยเกลือ และเป็นพื้นฐานของวิธีทำให้บริสุทธิ์ทั่วไปที่ใช้แอมโมเนียมซัลเฟตตกตะกอนโปรตีนออกจากสารผสม

อุณหภูมิ โดยทั่วไป การทำให้สารละลายอุ่นขึ้นจะเพิ่มการละลายจนถึงจุดหนึ่ง เมื่ออุณหภูมิเข้าใกล้จุดหลอมเหลวของโปรตีน โปรตีนจะเริ่มคลายโครงสร้าง การคลายโครงสร้างทำให้ส่วนที่ไม่ชอบน้ำของโปรตีน ซึ่งปกติซ่อนอยู่ภายในโครงสร้างที่พับตัวแล้ว เปิดออก ส่วนที่เปิดออกเหล่านี้จะเกาะกัน ทำให้เกิดการรวมตัว ดังนั้นการละลายจึงลดลงอย่างรวดเร็วเมื่ออุณหภูมิใกล้หรือสูงกว่าจุดหลอมเหลว

ตัวทำละลาย ค่าคงที่ไดอิเล็กทริกของตัวทำละลายเป็นค่าที่บอกประสิทธิภาพในการลดแรงดึงดูดทางไฟฟ้าระหว่างอนุภาคมีประจุ น้ำมีค่าคงที่ไดอิเล็กทริกสูงและแยกประจุได้ดี จึงเป็นเหตุให้โปรตีนส่วนใหญ่ละลายในน้ำได้ดีกว่าในตัวทำละลายอินทรีย์ เช่น เอทานอลหรืออะซีโตน ตัวทำละลายที่มีค่าคงที่ไดอิเล็กทริกต่ำทำให้ประจุตรงข้ามบนโมเลกุลโปรตีนต่างชนิดดึงดูดกันแรงขึ้น และส่งเสริมการรวมตัว

ข้อจำกัด

เครื่องคำนวณใช้แบบจำลองอย่างง่ายที่สร้างจากโปรตีนอ้างอิงและตัวทำละลายมาตรฐานจำนวนไม่มาก แบบจำลองนี้ไม่คำนึงถึงความบริสุทธิ์ของโปรตีน สารเติมแต่ง เช่น สารซักฟอกหรือสารทำให้คงตัว หรือองค์ประกอบบัฟเฟอร์ที่ผิดปกติ ผลลัพธ์เป็นค่าประมาณสำหรับการวางแผนการทดลอง ไม่ใช่สิ่งทดแทนการวัดการละลายโดยตรงในห้องปฏิบัติการ

คำถามที่พบบ่อย

การละลายของโปรตีนคืออะไร การละลายของโปรตีนคือความเข้มข้นสูงสุดของโปรตีนที่ยังคงละลายอย่างสมบูรณ์ในตัวทำละลาย โดยไม่เกิดการรวมตัวหรือตะกอนที่มองเห็นได้

เหตุใดโปรตีนจึงละลายได้น้อยที่สุดที่จุดไอโซอิเล็กทริก ที่จุดไอโซอิเล็กทริก โปรตีนไม่มีประจุไฟฟ้าสุทธิ ดังนั้นโมเลกุลโปรตีนจึงไม่ผลักกันทางไฟฟ้าอีกต่อไป เมื่อไม่มีแรงผลัก โมเลกุลเหล่านี้จึงมีแนวโน้มเกาะกันและหลุดออกจากสารละลายมากขึ้น

การเพิ่มการละลายด้วยเกลือและการลดการละลายด้วยเกลือต่างกันอย่างไร การเพิ่มการละลายด้วยเกลือเกิดขึ้นที่ความเข้มข้นเกลือต่ำ เมื่อไอออนที่ละลายอยู่บังหมู่ที่มีประจุของโปรตีนไม่ให้ดึงดูดกันและเพิ่มการละลาย ส่วนการลดการละลายด้วยเกลือเกิดขึ้นที่ความเข้มข้นเกลือสูง เมื่อไอออนดึงน้ำออกจากพื้นผิวโปรตีนและลดการละลาย

อุณหภูมิที่สูงขึ้นเพิ่มการละลายเสมอหรือไม่ ไม่ การละลายมักเพิ่มขึ้นตามอุณหภูมิเพียงจนถึงจุดหนึ่ง เมื่ออุณหภูมิเข้าใกล้จุดหลอมเหลวของโปรตีน โปรตีนจะเริ่มคลายโครงสร้าง ซึ่งมักทำให้เกิดการรวมตัวและการละลายลดลงอย่างรวดเร็ว

เหตุใดโปรตีนจึงละลายในเอทานอลหรืออะซีโตนได้น้อยกว่าในน้ำ น้ำมีค่าคงที่ไดอิเล็กทริกสูง ซึ่งหมายความว่าน้ำลดแรงดึงดูดทางไฟฟ้าระหว่างส่วนที่มีประจุของโมเลกุลโปรตีนได้อย่างมีประสิทธิภาพมาก เอทานอลและอะซีโตนมีค่าคงที่ไดอิเล็กทริกต่ำกว่า ดังนั้นหมู่ที่มีประจุบนโมเลกุลโปรตีนต่างชนิดจึงดึงดูดกันแรงขึ้นในตัวทำละลายเหล่านี้ ทำให้เกิดการรวมตัวได้ง่ายขึ้น

เครื่องคำนวณนี้แม่นยำเพียงใด เครื่องคำนวณให้ค่าประมาณจากแบบจำลองทางกายภาพและชุดโปรตีนกับตัวทำละลายอ้างอิงจำนวนไม่มาก มีประโยชน์สำหรับจำกัดช่วงสภาวะที่จะนำไปทดสอบ แต่การวัดเชิงทดลองยังเป็นวิธีเดียวที่จะยืนยันการละลายของตัวอย่างโปรตีนเฉพาะชนิดได้

อ่านเพิ่มเติม

• Arakawa, T., และ Timasheff, S. N. (1984). กลไกการเพิ่มการละลายและการลดการละลายของโปรตีนด้วยเกลือแคตไอออนสองประจุ Biochemistry, 23(25), 5912–5923
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., และ Pace, C. N. (2008). การวัดและเพิ่มการละลายของโปรตีน Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166
• Cohn, E. J., และ Edsall, J. T. (1943). โปรตีน กรดอะมิโน และเปปไทด์ในรูปไอออนและไอออนไดโพลาร์ Reinhold Publishing