Калькулятор концентрації білка

Калькулятор концентрації білка перетворює показник поглинання світла, отриманий спектрофотометром, на кількість білка, розчиненого в розчині. Результат зазвичай наводять у міліграмах на мілілітр (мг/мл) або мікрограмах на мілілітр (мкг/мл). Розрахунок ґрунтується на законі Бера—Ламберта — залежності в хімії, яка пов’язує кількість поглинутого зразком світла з кількістю речовини, що міститься в ньому.

Як вимірюють концентрацію білка

Більшість білків інтенсивно поглинає ультрафіолетове світло на довжині хвилі 280 нанометрів (нм). Це поглинання зумовлене переважно двома амінокислотами — триптофаном і тирозином, що входять до структури білка. Спектрофотометр пропускає світло крізь зразок і вимірює, яку його частину поглинає зразок. Цей показник називають абсорбцією, або A280, якщо вимірювання виконано на довжині хвилі 280 нм.

Вимірювання оптичної густини на довжині хвилі 280 нм є швидким і не руйнує зразок. Цим воно відрізняється від хімічних методів, таких як аналіз Bradford або BCA, описаних нижче. Метод найкраще працює для очищеного білка в розчині, якщо показник оптичної густини становить приблизно від 0,1 до 1,0. Показники за межами цього діапазону менш надійні, тому перед вимірюванням зразок часто потрібно розбавити.

Формула концентрації білка

Калькулятор перетворює закон Бера—Ламберта, щоб обчислити концентрацію:

C = (A × DF) / (ε × l)

C — концентрація білка в мг/мл
A — оптична густина на довжині хвилі 280 нм (звичайне число без одиниці вимірювання)
DF — коефіцієнт розведення, тобто у скільки разів початковий зразок розбавили перед вимірюванням
ε — коефіцієнт екстинкції, стала, специфічна для білка, у L/(g·cm)
l — довжина оптичного шляху, відстань, яку світло проходить крізь зразок, у сантиметрах (зазвичай 1 см у стандартній кюветі — невеликій скляній або пластиковій ємності, яку використовують у спектрофотометрі)

Щоб перевести результат у мікрограми на мілілітр, помножте значення в мг/мл на 1 000. Щоб визначити загальну масу білка у зразку, помножте концентрацію на об’єм зразка в мілілітрах.

Приклад обчислення

Оптична густина зразка становить 0,5 на довжині хвилі 280 нм. Зразок не розбавляли, тому коефіцієнт розведення дорівнює 1; вимірювання виконували у стандартній кюветі розміром 1 см. Білок є бичачим сироватковим альбуміном (BSA), коефіцієнт екстинкції якого становить 0,667 л/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 мг/мл

У зразку об’ємом 1 мл це становить приблизно 0,75 мг загального білка, або 750 мкг/мл.

Коефіцієнти поглинання поширених білків

Кожен білок поглинає світло по-різному, оскільки містить різну кількість залишків триптофану й тирозину. Коефіцієнт екстинкції описує цю властивість конкретного білка на довжині хвилі 280 нм в одиницях L/(g·cm). Серед поширених значень є такі:

Білок	Коефіцієнт екстинкції ε (L/(g·cm))
Бичачий сироватковий альбумін (BSA)	0,667
Імуноглобулін G (IgG)	1,38
Лізоцим	2,64
Овальбумін	0,73

Калькулятор також може приймати користувацький коефіцієнт екстинкції для білка, якого немає в цьому списку. Для білка з відомою амінокислотною послідовністю це значення можна оцінити за формулою, опублікованою Gill і von Hippel у 1989 році: ε₂₈₀ = (кількість залишків триптофану × 5 500) + (кількість залишків тирозину × 1 490) + (кількість залишків цистину × 125). Формула дає результат в M⁻¹cm⁻¹ — молярній одиниці, яка відрізняється від наведених вище масових значень у L/(g·cm). Безкоштовні інструменти, такі як ProtParam на сервері ExPASy, обчислюють це значення безпосередньо за послідовністю білка.

Довжина оптичного шляху та коефіцієнт розведення

Довжина оптичного шляху — це ширина кювети, що містить зразок, виміряна в сантиметрах. Стандартні кювети мають ширину 1 см. Спектрофотометри для мікрооб’ємів, призначені для вимірювання дуже малих зразків, можуть використовувати значно коротший оптичний шлях, наприклад 0,1 см.

Коефіцієнт розведення враховує будь-яке розбавлення, виконане перед вимірюванням. Якщо концентрований зразок давав би оптичну густину понад 1,0, його зазвичай спочатку розбавляють буфером. Коефіцієнт розведення дорівнює загальному об’єму розбавленого зразка, поділеному на початковий об’єм зразка. Наприклад, змішування 10 мкл зразка з 990 мкл буфера дає загальний об’єм 1 000 мкл і коефіцієнт розведення 100.

Інші способи вимірювання концентрації білка

Вимірювання оптичної густини на довжині хвилі 280 нм — один із кількох поширених лабораторних методів.

Аналіз Bradford: використовує барвник, який змінює колір, зв’язуючись із білком. Метод добре працює з неочищеними зразками, але зміна кольору може відрізнятися для різних білків.
Аналіз BCA: ґрунтується на зміні кольору, спричиненій пептидними зв’язками білка. Він сумісний із багатьма детергентами, але потребує більше часу, ніж пряме вимірювання оптичної густини.
Метод Лоурі: старіший метод, який має високу чутливість, але погано реагує на деякі поширені компоненти буферів.

Кожен із цих трьох методів руйнує зразок. Пряме вимірювання A280 — ні, тому той самий зразок можна зберегти й використати повторно.

Поширені запитання

Який діапазон оптичної густини є оптимальним для цього методу?

Від 0,1 до 1,0. Нижче 0,1 показник є неточним. Вище 1,0 залежність між оптичною густиною та концентрацією може перестати бути лінійною, тому зразок спочатку слід розбавити.

Чому вимірюють на довжині хвилі 280 нм, а не 260 нм?

Нуклеїнові кислоти, такі як ДНК і РНК, інтенсивно поглинають світло на довжині хвилі 260 нм. Білки сильніше поглинають світло на довжині хвилі 280 нм через вміст триптофану й тирозину. Вимірювання на довжині хвилі 280 нм зменшує вплив нуклеїнових кислот, присутніх у зразку.

Як визначити коефіцієнт екстинкції для білка, якого немає в списку?

Для білка з відомою послідовністю такий інструмент, як ProtParam, обчислює коефіцієнт екстинкції за кількістю залишків триптофану, тирозину й цистину. Його також можна виміряти безпосередньо, порівнявши оптичну густину зразка з оптичною густиною розчину відомої концентрації.

Чи працює цей метод для суміші білків?

Він найкраще працює для одного очищеного білка з відомим коефіцієнтом екстинкції. Суміш невідомих білків, наприклад клітинний лізат, зазвичай вимірюють за допомогою аналізу Bradford або BCA, оскільки ці методи дають узгодженішу оцінку загальної кількості білка.

Чи можуть детергенти впливати на показник?

Так. Багато детергентів поглинають світло поблизу 280 нм, що може спотворити результат. Використання холостого зразка з такою самою концентрацією детергенту допомагає компенсувати це фонове поглинання. За дуже високих концентрацій детергенту може знадобитися аналіз, сумісний із детергентами, наприклад BCA.

Калькулятор концентрації білка | A280 до мг/мл