Калькулятор розчинності білків - Безкоштовний інструмент pH та температури

Калькулятор розчинності білка оцінює найвищу концентрацію білка, що залишається розчиненим у розчиннику за заданих pH, температури та йонної сили. Він перетворює базові положення хімії на одне число — міліграми білка на мілілітр розчинника.

Розчинність білка має значення в біохімії, розробленні лікарських засобів і харчовій науці. Білок, який не залишається розчиненим, утворює агрегати або осад, що може зіпсувати експеримент або зробити препарат непридатним для ін’єкцій.

Як розрахувати розчинність білка

Розчинність залежить від п’яти чинників: ізоелектричної точки білка (значення pH, за якого його сумарний заряд дорівнює нулю), температури плавлення (температури, за якої він починає денатуруватися), діелектричної проникності розчинника (показника того, наскільки добре він розділяє заряджені частинки), pH розчину та йонної сили (показника кількості розчиненої солі).

Калькулятор бере за основу відому розчинність кожного білка у воді за еталонних умов: 25 °C, pH 7,0 і йонної сили 0,15 M (приблизно такого самого рівня солі, як у крові). Потім він множить це еталонне значення на чотири коефіцієнти — по одному для кожної зміненої умови.

Формула розчинності білка

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ — відома розчинність білка у воді за еталонних умов, у мг/мл.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, де $pI$ — ізоелектрична точка білка. Розчинність найнижча в ізоелектричній точці й зростає в міру віддалення pH від неї, стабілізуючись у межах кількох одиниць pH.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, де $I$ — йонна сила в молях на літр. За низького вмісту солі цей коефіцієнт трохи підвищує розчинність («всолювання»). За високого вмісту солі він знижує розчинність («висолювання»).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, де $T_m$ — температура плавлення білка в °C. Розчинність поступово зростає з температурою, а потім різко падає, коли температура наближається до $T_m$ і білок починає денатуруватися.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, де $\varepsilon$ — діелектрична проникність розчинника. Діелектрична проникність води дорівнює 78,4, тому у воді цей коефіцієнт дорівнює 1. Розчинники, які розділяють заряди менш ефективно, ніж вода, наприклад етанол, знижують розчинність.

Еталонні значення, які використовує калькулятор

Категорії розчинності

Приклад: альбумін у фосфатному буфері

Визначимо розчинність альбуміну у фосфатному буфері за 25 °C, pH 7,4 і йонної сили 0,15 M.

Еталонні значення для альбуміну: $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ мг/мл і $T_m = 63°C$. Діелектрична проникність фосфатного буфера дорівнює 76,0.

1. Коефіцієнт pH: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Співвідношення: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Йонний коефіцієнт: йонна сила (0,15 M) дорівнює еталонному значенню, тому співвідношення дорівнює 1.
3. Температурний коефіцієнт: температура (25 °C) дорівнює еталонному значенню, тому співвідношення дорівнює 1.
4. Коефіцієнт розчинника: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ мг/мл}$

Калькулятор показує 492,12 мг/мл, що відповідає категорії «високорозчинний».

Приклад: лізоцим у гліцерині за низької температури

Визначимо розчинність лізоциму в розчині гліцерину за 4 °C, pH 5,0 і йонної сили 0,1 M. Це умови, подібні до умов холодового зберігання ферменту.

Еталонні значення для лізоциму: $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ мг/мл і $T_m = 72°C$. Діелектрична проникність гліцерину дорівнює 42,5.

1. Коефіцієнт pH: зміна pH з 7,0 на pH 5,0 (обидва значення значно нижчі за pI 11,35) лише незначно змінює коефіцієнт pH. Співвідношення: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Іонний коефіцієнт: зниження іонної сили з 0,15 M до 0,1 M трохи підвищує розчинність завдяки ефекту всолювання. Співвідношення: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Температурний член: охолодження від 25 °C до 4 °C, значно нижче температури плавлення, знижує цей показник. Співвідношення: 0,8106.
4. Коефіцієнт розчинника: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ мг/мл}$

Калькулятор показує 35,88 мг/мл, що відповідає категорії «розчинний». Саме низька діелектрична проникність гліцерину, а не низька температура, зменшує результат порівняно з еталонним значенням.

Як користуватися калькулятором розчинності білка

1. Виберіть білок зі списку: альбумін, інсулін, лізоцим, гемоглобін, міоглобін, колаген, казеїн або фібриноген.
2. Виберіть розчинник: воду, фосфатний буфер, трис-буфер, гліцерин, ДМСО, метанол, етанол або ацетон.
3. Введіть температуру в °C (від 0 до 100), pH (від 0 до 14) і молярну йонну силу (від 0 до 2).
4. Перегляньте розраховану розчинність у мг/мл і відповідну категорію. Смужка під результатом показує значення на шкалі від 0 до 100 мг/мл і повністю заповнюється за значення 100 мг/мл або більше.

Що впливає на розчинність білка

pH та ізоелектрична точка. Кожен білок має ізоелектричну точку — значення pH, за якого його поверхня не має сумарного електричного заряду. За такого pH молекули білка не відштовхуються одна від одної, тому злипаються й легше випадають із розчину. Зміщення pH від ізоелектричної точки в будь-якому напрямку надає білку сумарного заряду. Заряджені молекули відштовхуються одна від одної, завдяки чому залишаються розділеними й розчиненими.

Йонна сила. Розчинені йони солі оточують заряджені групи на поверхні білка. За низьких і помірних концентрацій ці йони екранують заряди, які інакше притягували б дві молекули білка, що підвищує розчинність. Це називається всолюванням (salting in). За високих концентрацій солі йони конкурують із білком за молекули води, відриваючи шар води, який утримує білок у розчині. Це називається висолюванням (salting out) і є основою поширеного методу очищення, у якому для осадження білків із суміші використовують сульфат амонію.

Температура. Нагрівання розчину зазвичай підвищує розчинність до певної межі. Коли температура наближається до температури плавлення білка, білок починає розгортатися. Розгортання відкриває гідрофобні (такі, що відштовхують воду) ділянки білка, які зазвичай приховані всередині його нативної структури. Відкриті ділянки злипаються між собою, спричиняючи агрегацію, тому поблизу температури плавлення та за вищих температур розчинність різко падає.

Розчинник. Діелектрична проникність розчинника показує, наскільки ефективно він послаблює електричне притягання між зарядженими частинками. Вода має високу діелектричну проникність і добре розділяє заряди, тому більшість білків краще розчиняється у воді, ніж в органічних розчинниках, таких як етанол або ацетон. Розчинники з низькою діелектричною проникністю дають змогу протилежним зарядам на різних молекулах білка сильніше притягуватися, сприяючи агрегації.

Обмеження

Калькулятор використовує спрощену модель, побудовану на невеликому наборі еталонних білків і стандартних розчинників. Вона не враховує чистоту білка, добавки на кшталт детергентів або стабілізаторів, а також незвичайні компоненти буферів. Результати є оцінками для планування експериментів, а не заміною прямого вимірювання розчинності в лабораторії.

Поширені запитання

Що таке розчинність білка? Розчинність білка — це максимальна концентрація білка, яка залишається повністю розчиненою в розчиннику без утворення видимих агрегатів або осаду.

Чому розчинність білка найнижча в його ізоелектричній точці? В ізоелектричній точці білок не має сумарного електричного заряду, тому молекули білка більше не відштовхуються електрично. Без цього відштовхування вони з більшою ймовірністю злипаються й випадають із розчину.

У чому різниця між всолюванням (salting in) і висолюванням (salting out)? Всолювання відбувається за низьких концентрацій солі, коли розчинені йони екранують заряджені групи білка одна від одної та підвищують розчинність. Висолювання відбувається за високих концентрацій солі, коли йони відбирають воду від поверхні білка та знижують розчинність.

Чи завжди вища температура підвищує розчинність? Ні. Розчинність зазвичай зростає з температурою лише до певної межі. Коли температура наближається до температури плавлення білка, він починає розгортатися, що зазвичай спричиняє агрегацію та різке падіння розчинності.

Чому білки гірше розчиняються в етанолі або ацетоні, ніж у воді? Вода має високу діелектричну проникність, тобто дуже ефективно послаблює електричне притягання між зарядженими частинами молекул білка. Етанол і ацетон мають нижчу діелектричну проникність, тому заряджені групи на різних молекулах білка сильніше притягуються в цих розчинниках, що підвищує ймовірність агрегації.

Наскільки точний цей калькулятор? Він дає оцінку на основі фізичної моделі та невеликого набору еталонних білків і розчинників. Калькулятор допомагає звузити діапазон умов для перевірки, але лише експериментальне вимірювання дає змогу підтвердити розчинність конкретного зразка білка.

Додаткові матеріали

• Arakawa, T., & Timasheff, S. N. (1984). Механізм всолювання і висолювання білків солями двовалентних катіонів. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., & Pace, C. N. (2008). Вимірювання та підвищення розчинності білків. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J., & Edsall, J. T. (1943). Білки, амінокислоти та пептиди як йони й цвітеріони. Reinhold Publishing.