Máy Tính Nhiệt Độ Gắn Mồi DNA | Công Cụ Tm PCR Miễn Phí

Máy tính nhiệt độ gắn mồi DNA là gì?

Máy tính nhiệt độ gắn mồi DNA ước tính nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi DNA dựa trên trình tự của mồi. Tm là nhiệt độ tại đó một nửa số phân tử mồi liên kết với mạch đích và một nửa không liên kết. Trong phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase (PCR), giá trị này giúp xác định nhiệt độ để mồi gắn vào DNA khuôn.

Vì sao nhiệt độ gắn mồi quan trọng trong PCR

PCR sao chép một đoạn DNA đích qua các chu kỳ gia nhiệt và làm nguội lặp lại. Mỗi chu kỳ gồm ba bước. Trước hết, gia nhiệt làm tách khuôn DNA mạch kép ở khoảng 95 °C. Bước này được gọi là biến tính. Tiếp theo, phản ứng được làm nguội đến nhiệt độ gắn mồi, thường nằm trong khoảng từ 50 °C đến 65 °C, để các mồi ngắn có thể liên kết với những trình tự tương ứng trên các mạch đơn. Sau đó, nhiệt độ tăng lên khoảng 72 °C, và một enzyme có tên là DNA polymerase kéo dài các mồi để tạo các mạch DNA mới.

Nếu nhiệt độ gắn mồi quá thấp, mồi sẽ liên kết với những trình tự chỉ tương đồng một phần, tạo ra các đoạn DNA phụ không mong muốn. Nếu nhiệt độ quá cao, mồi không thể tạo liên kết ổn định với khuôn, và rất ít hoặc không có DNA được sao chép. Nhiệt độ gắn mồi là một trong những thông số đầu tiên mà các nhà nghiên cứu điều chỉnh khi phản ứng PCR không đạt kết quả.

Hàm lượng GC ảnh hưởng đến Tm như thế nào

Mồi bắt cặp với trình tự đích thông qua các liên kết hydro. Một cặp guanin–cytosin (G-C) hình thành ba liên kết hydro. Một cặp adenin–thymin (A-T) hình thành hai liên kết. Mồi có nhiều base G và C hơn cần nhiều nhiệt hơn để tách rời, vì vậy có Tm cao hơn mồi có cùng độ dài nhưng nhiều base A và T hơn. Hàm lượng GC thường được biểu thị dưới dạng phần trăm: số base G và C chia cho tổng độ dài trình tự, rồi nhân với 100.

Công thức tính nhiệt độ gắn mồi DNA

Máy tính này áp dụng một trong hai công thức, được lựa chọn dựa trên độ dài của mồi.

Với các mồi có 14 nucleotide trở lên, máy tính sử dụng công thức hàm lượng GC của Marmur-Doty:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Ở đây, N_GC là số base G và C trong mồi, được đếm trực tiếp thay vì biểu thị dưới dạng phần trăm. N là tổng số base.

Với các mồi ngắn hơn 14 nucleotide, máy tính sử dụng quy tắc Wallace:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G và C lần lượt biểu thị số lượng của mỗi base đó trong mồi.

Cả hai công thức đều giả định các điều kiện PCR thông thường: nồng độ mồi khoảng 50 nanomolar và nồng độ Na+ khoảng 50 milimolar.

Ví dụ minh họa

Xét mồi có 19 base ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Độ dài của mồi là 19, bằng hoặc lớn hơn 14, nên máy tính sử dụng công thức Marmur-Doty.

• Độ dài (N) = 19
• Số lượng G = 5, số lượng C = 5, do đó N_GC = 10, và hàm lượng GC là 10 / 19 × 100 ≈ 52,6%
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

Công thức sử dụng số lượng GC là 10, không phải phần trăm GC là 52,6. Nếu sử dụng nhầm phần trăm, Tm sẽ gần bằng 143 °C, đây không phải giá trị thực tế đối với phản ứng PCR vận hành trong khoảng từ 50 °C đến 95 °C.

Cách sử dụng máy tính này

Nhập hoặc dán trình tự mồi chỉ sử dụng các chữ cái A, T, G và C. Máy tính hiển thị độ dài trình tự tính bằng nucleotide (nt), hàm lượng GC theo phần trăm và nhiệt độ bắt cặp được tính bằng độ C. Có thể sao chép kết quả để ghi chép trong phòng thí nghiệm hoặc đưa vào quy trình.

Lựa chọn nhiệt độ gắn mồi cho PCR

Tm là giá trị ước tính được tính toán, không phải nhiệt độ hoạt động được bảo đảm. Nhiều quy trình PCR bắt đầu bước gắn mồi thực tế ở nhiệt độ thấp hơn Tm tính toán vài độ, sau đó điều chỉnh dựa trên kết quả điện di gel. Với một cặp mồi, thông thường giá trị Tm thấp hơn trong hai mồi được dùng làm điểm bắt đầu. PCR gradient, trong đó nhiều phản ứng được tiến hành đồng thời ở một dải nhiệt độ, là cách phổ biến để tìm nhiệt độ tối ưu bằng thử nghiệm.

Các cách khác để ước tính Tm

Các công thức Marmur-Doty và Wallace được sử dụng ở đây là những phép gần đúng nhanh, chỉ dựa trên thành phần base. Ngoài ra còn có các phương pháp khác:

• Phương pháp nhiệt động học dựa trên các cặp bazơ lân cận tính đến ảnh hưởng của từng cặp bazơ liền kề lên độ ổn định và được xem là phương pháp chính xác hơn đối với các mồi thông thường.
• Các công thức hiệu chỉnh theo muối tính đến nồng độ ion Na+ hoặc K+ trong dung dịch đệm phản ứng, vì nồng độ muối cao hơn làm ổn định chuỗi xoắn kép DNA và tăng Tm.

Các máy tính khác nhau có thể cho các giá trị Tm khác nhau đối với cùng một mồi vì chúng sử dụng các công thức khác nhau. Tiến hành PCR và kiểm tra kết quả vẫn là phép thử cuối cùng.

Các câu hỏi thường gặp

Nhiệt độ gắn mồi DNA là gì?

Đó là nhiệt độ tại đó các mồi DNA liên kết với trình tự tương ứng trên mạch khuôn trong quá trình PCR. Các phòng thí nghiệm thường đặt nhiệt độ này thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) tính toán của mồi vài độ.

Tm của mồi được tính như thế nào?

Với các mồi có 14 base trở lên, Tm = 64,9 + 41 × (số GC − 16,4) / độ dài. Với các mồi ngắn hơn 14 base, Tm = 2 × (số A+T) + 4 × (số G+C).

Vì sao hàm lượng GC làm tăng Tm?

Các cặp base G-C hình thành ba liên kết hydro, trong khi các cặp A-T chỉ hình thành hai liên kết. Mồi có tỷ lệ base G và C cao hơn cần nhiều năng lượng hơn, do đó cần nhiệt độ cao hơn, để tách khỏi trình tự đích.

Nhiệt độ gắn mồi của PCR có nên bằng Tm tính toán không?

Không. Hầu hết các quy trình bắt đầu ở nhiệt độ thấp hơn Tm tính toán vài độ rồi điều chỉnh từ đó, vì Tm đánh dấu điểm mà chỉ một nửa số mồi liên kết.

Độ dài của mồi có làm thay đổi Tm không?

Có, nhưng không theo cách đơn giản. Độ dài nằm ở mẫu số của công thức Marmur-Doty, vì vậy một mồi dài hơn có hàm lượng GC trung bình không tự động có Tm cao hơn một mồi ngắn hơn nhưng giàu GC.

Vì sao các máy tính Tm khác nhau cho kết quả không giống nhau?

Chúng sử dụng các công thức khác nhau. Quy tắc Wallace, công thức hàm lượng GC của Marmur-Doty, nhiệt động học lân cận gần nhất và các công thức hiệu chỉnh theo muối đều có thể cho Tm khác nhau đối với cùng một mồi, đôi khi chênh nhau vài độ.

Tài liệu tham khảo

1. Marmur J, Doty P. Xác định thành phần base của axit deoxyribonucleic từ nhiệt độ biến tính nhiệt của nó. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Sự lai hóa của các oligonucleotide deoxyribonucleic tổng hợp với DNA phi-chi 174. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. Quan điểm thống nhất về nhiệt động học lân cận gần nhất của DNA polymer, DNA hình quả tạ và oligonucleotide. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.