حاسبة تخفيف الخلايا - أداة مخبرية دقيقة للتخفيف

حاسبة تخفيف الخلايا

تحدد حاسبة تخفيف الخلايا كمية معلّق الخلايا وكمية المُخفِّف اللتين يجب مزجهما للوصول إلى تركيز خلوي مستهدف في حجم نهائي محدد. وتُستخدم في زراعة الخلايا وعلم الأحياء الدقيقة وغيرهما من الأعمال المخبرية التي تتطلب ضبط العينة على تركيز دقيق قبل استخدامها.

ما المقصود بتخفيف الخلايا

لا يغيّر تخفيف معلّق الخلايا عدد الخلايا التي يحتوي عليها، بل يغيّر فقط الحجم الذي توجد فيه الخلايا، مما يخفض التركيز. فالمعلّق الذي عُدَّ بتركيز 1,000,000 خلية لكل مليلتر (خلية/مل) يظل يحتوي على العدد الإجمالي نفسه من الخلايا بعد التخفيف. إنما يتوزع ذلك العدد ببساطة في كمية أكبر من السائل.

تُخفف المختبرات الخلايا قبل العديد من الخطوات الروتينية: تقسيم مزرعة نامية في دوارق جديدة، أو زرع عدد ثابت من الخلايا في كل بئر من آبار صفيحة، أو تجميد الخلايا للتخزين، أو إعداد عينة لعداد خلايا أو مقياس التدفق الخلوي.

معادلة تخفيف الخلايا

يعتمد الحساب على قاعدة واحدة: يجب أن يساوي عدد الخلايا المأخوذة من المعلّق الأصلي، مضروبًا في تركيزه، عدد الخلايا في الحجم النهائي، مضروبًا في التركيز المستهدف:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — التركيز الابتدائي (تركيز المعلّق الأصلي)، بوحدة خلية/مل
• V₁ — حجم المعلّق الأصلي المستخدم، بوحدة مل
• C₂ — التركيز المستهدف، بوحدة خلية/مل
• V₂ — الحجم النهائي الكلي المطلوب، بوحدة مل

بحل المعادلة لإيجاد V₁ نحصل على حجم المعلّق الأصلي الذي يجب سحبه بالماصة:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

أما باقي الحجم النهائي فهو المُخفِّف، وعادةً ما يكون وسط زراعة الخلايا أو المحلول الملحي المنظّم بالفوسفات (PBS) أو محلولًا منظّمًا آخر:

حجم المُخفِّف = V₂ − V₁

لا يمكن أن يكون التركيز المستهدف (C₂) أعلى من تركيز المعلّق الأصلي (C₁). فالتخفيف يخفض التركيز فقط. ولرفعه، يجب ترسيب الخلايا بالطرد المركزي ثم إعادة تعليقها في كمية أقل من السائل.

كيفية حساب تخفيف الخلايا

1. عُدَّ المعلّق المخزون باستخدام مقياس الهيموسيتومتر أو عدّاد خلايا آلي للحصول على C₁.
2. دوّن التركيز المستهدف، C₂، الذي يتطلبه البروتوكول.
3. حدّد الحجم النهائي الكلي، V₂، المطلوب.
4. احسب V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
5. احسب حجم المُخفِّف على النحو التالي: V₂ − V₁.
6. اسحب بالماصة V₁ من المعلّق الأصلي إلى أنبوب، ثم أضف حجم المُخفِّف من الوسط أو المحلول المنظّم.

مثال محلول

عُدَّ معلّق أصلي بتركيز 1,000,000 خلية/مل. ويتطلب البروتوكول تركيزًا قدره 100,000 خلية/مل في حجم نهائي مقداره 10 ملتر.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100,000 × 10) ÷ 1,000,000 = 1,000,000 ÷ 1,000,000 = 1 ملتر

حجم المُخفِّف = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 ملتر

يؤدي أخذ 1 ملتر من المعلّق الأصلي وإضافة 9 ملتر من الوسط إلى الحصول على 10 ملتر من المعلّق بتركيز 100,000 خلية/مل.

مثال ثانٍ

يحتاج اختبار على صفيحة ذات 96 بئرًا إلى 10,000 خلية في كل بئر ضمن 200 ميكرولتر (μL) من الوسط لكل بئر. وهذا يعادل تركيزًا مستهدفًا قدره 50,000 خلية/مل، لأن قسمة 10,000 خلية على 0.2 ملتر تساوي 50,000 خلية/مل. ويبلغ تركيز المعلّق الأصلي 2,000,000 خلية/مل، ويلزم حجم إجمالي قدره 20 ملتر لتغطية الصفيحة مع كمية إضافية لتعويض فاقد السحب بالماصة.

V₁ = (50,000 × 20) ÷ 2,000,000 = 1,000,000 ÷ 2,000,000 = 0.5 ملتر

حجم المُخفِّف = 20 − 0.5 = 19.5 ملتر

يؤدي مزج 0.5 ملتر من المعلّق الأصلي مع 19.5 ملتر من الوسط إلى الحصول على 20 ملتر بتركيز 50,000 خلية/مل، أي تخفيف بنسبة 1 من كل 40.

مصادر الخطأ

المعادلة نفسها دقيقة، أما الأخطاء فتنشأ من الأرقام المُدخلة فيها.

• خطأ العدّ. يؤدي عدّ خاطئ للخلايا مباشرةً إلى تخفيف خاطئ. ويقلل عدّ المربعات الأربعة الموجودة في زوايا شبكة المقياس الدموي وحساب متوسطها من هذا الخطر.
• الخلايا المتكتلة. تبدو كتلة الخلايا خلية واحدة تحت المجهر، لكنها في الحقيقة عدة خلايا، ولذلك تخفض التركيز الظاهري.
• نطاق الماصة. تعطي الماصة المستخدمة خارج نطاق الحجم المحدد لها نتائج غير دقيقة. فالمــاصة ذات سعة 1000 μL المضبوطة لسحب 5 μL لا يُعتمد عليها؛ وينبغي استخدام ماصة أصغر بدلًا منها.
• الخلط بين الوحدات. يؤدي الخلط بين خلية/مل وخلية/μL إلى خطأ أكبر أو أصغر بألف مرة.
• الخلايا الميتة. يشمل العدّ الخام للخلايا الخلايا الميتة ما لم تُستخدم صبغة حيوية مثل أزرق التريبان. وقد يؤدي ذلك إلى المبالغة في تقدير عدد الخلايا الحية الموجودة فعليًا.

حدود هذه الحاسبة

ترفض الحاسبة الأرقام التي لا يمكنها إعطاء نتيجة مفيدة بها:

• يجب أن تكون كل قيمة أكبر من الصفر.
• لا يمكن أن يكون التركيز المستهدف أعلى من التركيز الابتدائي.
• يجب ألا يتجاوز التركيز الابتدائي 1 تريليون خلية/مل (1 × 10¹²).
• يجب ألا يقل حجم المعلّق الأصلي الذي تحسبه عن 0.001 ملتر، أي 1 ميكرولتر. ولا يمكن سحب أي حجم أصغر بدقة، لذلك تطلب الحاسبة أرقامًا مختلفة بدلًا من ذلك. وعادةً ما يحل رفع الحجم الكلي هذه المشكلة.

تُعرض الأحجام حتى منزلتين عشريتين، أو حتى ثلاث منازل عندما يكون حجم المعلّق الأصلي أقل من 0.01 ملتر، حتى لا يظهر الحجم الصغير على صورة 0.00 ملتر.

الأسئلة الشائعة

ما معادلة تخفيف الخلايا؟

C₁ × V₁ = C₂ × V₂، حيث إن C₁ وC₂ هما التركيزان الابتدائي والمستهدف، وV₁ وV₂ هما الحجم المأخوذ من المعلّق الأصلي والحجم النهائي الكلي.

هل يمكن أن يكون التركيز المستهدف أعلى من التركيز الابتدائي؟

لا. فالتخفيف يخفض التركيز فقط. ويتطلب الوصول إلى تركيز أعلى طرد الخلايا مركزيًا وإعادة تعليقها في حجم أصغر.

ما السائل الذي ينبغي استخدامه لتخفيف الخلايا؟

يُستخدم وسط زراعة كامل عندما يجب أن تبقى الخلايا سليمة لساعات أو أيام، كما قبل زرعها في صفيحة. ويصلح PBS أو محلول ملحي منظّم مماثل للتخفيفات القصيرة، التي تقل مدتها عن نحو 30 دقيقة، قبل إجراء معالجة إضافية للخلايا. ويُستخدم وسط خالٍ من المصل عندما تتداخل بروتينات المصل مع اختبار لاحق.

هل تصلح هذه المعادلة للبكتيريا أو الخميرة؟

نعم. تنطبق C₁V₁ = C₂V₂ على أي معلّق من الجسيمات، بما في ذلك البكتيريا المقاسة بوحدات تكوين المستعمرات لكل مليلتر (CFU/mL)، والخميرة، والجسيمات الفيروسية المقاسة بوحدات تكوين اللويحات لكل مليلتر (PFU/mL)، ما دامت الوحدات نفسها مستخدمة على طرفي المعادلة.

هل ينبغي عدّ الخلايا الميتة ضمن التخفيف؟

عند زرع مزرعة حية، ينبغي عدّ الخلايا القابلة للحياة فقط. فإذا كان المعلّق قابلًا للحياة بنسبة 80%، فإن تركيزه القابل للحياة يساوي 0.8 من إجمالي عدد الخلايا، وينبغي استخدام ذلك التركيز القابل للحياة بوصفه C₁.

كيف يمكن إجراء تخفيفات كبيرة بدقة؟

تُجرى التخفيفات الكبيرة، مثل 1 من كل 1000، عادةً على هيئة سلسلة من الخطوات الأصغر تُسمى التخفيفات المتسلسلة. وتوصل ثلاثة تخفيفات متتالية بنسبة 1 من كل 10 إلى تخفيف إجمالي بنسبة 1 من كل 1000، مع إبقاء كل خطوة من خطوات السحب بالماصة ضمن نطاق حجم دقيق.