حاسبة درجة حرارة التهجين الدنا | أداة Tm مجانية للتفاعل المتسلسل للبوليميراز

ما حاسبة درجة حرارة تلدين الحمض النووي DNA؟

تقدّر حاسبة درجة حرارة تلدين الحمض النووي درجة انصهار (Tm) بادئ DNA انطلاقًا من تتابعه. وTm هي درجة الحرارة التي يرتبط عندها نصف جزيئات البادئ بالسلسلة الهدف، بينما لا يرتبط النصف الآخر بها. في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، توجّه هذه القيمة اختيار درجة الحرارة المستخدمة لارتباط البوادئ بقالب DNA.

لماذا تهم درجة حرارة التلدين في تفاعل PCR

ينسخ تفاعل PCR قطعة مستهدفة من DNA عبر دورات متكررة من التسخين والتبريد. تتكون كل دورة من ثلاث خطوات. أولًا، تفصل الحرارة القالب مزدوج السلسلة عند نحو 95 °م. وتُسمى هذه الخطوة التمسخ. ثانيًا، يبرد التفاعل إلى درجة حرارة التلدين، التي تتراوح عادةً بين 50 °م و65 °م، كي ترتبط البوادئ القصيرة بالتتابعات المطابقة على السلاسل المفردة. ثالثًا، ترتفع درجة الحرارة إلى نحو 72 °م، ويعمل إنزيم يُسمى بوليميراز DNA على إطالة البوادئ لبناء سلاسل DNA جديدة.

إذا كانت درجة حرارة التلدين منخفضة جدًا، ترتبط البوادئ بتتابعات متطابقة جزئيًا فقط، ما ينتج شظايا DNA إضافية غير مرغوبة. وإذا كانت مرتفعة جدًا، لا تستطيع البوادئ تكوين رابطة مستقرة مع القالب، ولا يُنسخ إلا قدر قليل من DNA أو لا يُنسخ شيء. وتُعد درجة حرارة التلدين من أولى الإعدادات التي يضبطها الباحثون عند فشل تفاعل PCR.

كيف يؤثر محتوى GC في Tm

يرتبط البادئ بالهدف من خلال روابط هيدروجينية. ويكوّن زوج الغوانين-السيتوزين (G-C) ثلاث روابط هيدروجينية، بينما يكوّن زوج الأدينين-الثايمين (A-T) رابطتين. ويحتاج البادئ الذي يحتوي على عدد أكبر من قواعد G وC إلى حرارة أعلى لفصل سلسلتيه، ولذلك تكون قيمة Tm لديه أعلى من قيمة Tm لبادئ بالطول نفسه يحتوي على عدد أكبر من قواعد A وT. ويُكتب محتوى GC عادةً كنسبة مئوية: عدد قواعد G وC مقسومًا على إجمالي طول التتابع، ثم مضروبًا في 100.

معادلة درجة حرارة تلدين DNA

تطبّق هذه الحاسبة إحدى معادلتين، ويُختار بينهما حسب طول البادئ.

للبوادئ التي يبلغ طولها 14 نوكليوتيدًا أو أكثر، تستخدم معادلة مارمور-دوتي لمحتوى GC:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

يشير N_GC هنا إلى عدد قواعد G وC في البادئ، محسوبًا مباشرةً لا كنسبة مئوية. أما N فهو إجمالي عدد القواعد.

للبوادئ الأقصر من 14 نوكليوتيدًا، تستخدم قاعدة والاس:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

يرمز كل من A وT وG وC إلى عدد تلك القاعدة في البادئ.

تفترض كلتا المعادلتين ظروف PCR شائعة: نحو 50 نانومولار من البادئ و50 مليمولار من +Na.

مثال محلول

لنأخذ البادئ المؤلف من 19 قاعدة، وهو ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. يبلغ طوله 19، أي 14 قاعدة أو أكثر، ولذلك تستخدم الحاسبة معادلة مارمور-دوتي.

• الطول (N) = 19
• عدد G = 5، وعدد C = 5، ومن ثم فإن N_GC = 10، ومحتوى GC هو 10 / 19 × 100 ≈ 52.6%
• Tm = 64.9 + 41 × (10 − 16.4) / 19 = 64.9 + 41 × (−6.4) / 19 = 64.9 − 13.8 ≈ 51.1 °م

تستخدم المعادلة عدد GC، وهو 10، وليس النسبة المئوية لمحتوى GC، وهي 52.6. ويؤدي استخدام النسبة المئوية بالخطأ إلى قيمة Tm تقترب من 143 °م، وهي قيمة غير واقعية لتفاعل PCR يعمل بين 50 °م و95 °م.

كيفية استخدام هذه الحاسبة

اكتب تتابع البادئ أو ألصقه، مستخدمًا الأحرف A وT وG وC فقط. تعرض الحاسبة طول التتابع بالنوكليوتيدات (nt)، ومحتوى GC كنسبة مئوية، ودرجة حرارة التلدين المحسوبة بالدرجات المئوية. ويمكن نسخ النتيجة لإدراجها في ملاحظات المختبر أو في بروتوكول.

اختيار درجة حرارة التلدين في تفاعل PCR

تُعد Tm تقديرًا محسوبًا وليست درجة حرارة تشغيل مضمونة. تبدأ بروتوكولات PCR كثيرة خطوة التلدين الفعلية بدرجات قليلة تحت قيمة Tm المحسوبة، ثم تضبطها استنادًا إلى النتيجة على الهلام. وبالنسبة إلى زوج من البوادئ، تُستخدم عادةً قيمة Tm الأقل بين البادئين كنقطة بداية. ويُعد PCR المتدرج، الذي يشغّل عدة تفاعلات عبر نطاق من درجات الحرارة في الوقت نفسه، طريقة شائعة للعثور على أفضل درجة حرارة من خلال الاختبار.

طرق أخرى لتقدير Tm

تُعد معادلتَا مارمور-دوتي ووالاس المستخدمتان هنا تقريبيتين سريعتين تستندان إلى تركيب القواعد وحده. وتوجد طرق أخرى:

• تأخذ الديناميكا الحرارية بطريقة الجار الأقرب في الحسبان تأثير كل زوج من القواعد المتجاورة في الثبات، وتُعد الطريقة الأدق للبوادئ القياسية.
• تضيف المعادلات المصححة بالملح تصحيحًا لتركيز أيونات Na+ أو K+ في المحلول المنظِّم للتفاعل، إذ إن ارتفاع تركيز الملح يثبت مزدوج DNA ويرفع قيمة Tm.

قد تعرض الحاسبات المختلفة قيم Tm مختلفة للبادئ نفسه لأنها تستخدم معادلات مختلفة. ويظل إجراء تفاعل PCR والتحقق من النتيجة الاختبار النهائي.

الأسئلة الشائعة

ما درجة حرارة تلدين DNA؟

هي درجة الحرارة التي ترتبط عندها بوادئ DNA بالتتابع المطابق لها على سلسلة القالب أثناء تفاعل PCR. وتضبط المختبرات هذه الدرجة عادةً على بضع درجات تحت درجة انصهار البادئ المحسوبة (Tm).

كيف تُحسب Tm للبادئ؟

للبوادئ التي يبلغ طولها 14 قاعدة أو أكثر، تكون Tm = 64.9 + 41 × (عدد GC − 16.4) / الطول. أما للبوادئ الأقصر من 14 قاعدة، فتكون Tm = 2 × (عدد A+T) + 4 × (عدد G+C).

لماذا يرفع محتوى GC قيمة Tm؟

تكوّن أزواج قواعد G-C ثلاث روابط هيدروجينية، مقارنةً برابطتين لأزواج A-T. ويحتاج البادئ الذي يحتوي على نسبة أعلى من قواعد G وC إلى طاقة أكبر، وبالتالي إلى درجة حرارة أعلى، لينفصل عن هدفه.

هل ينبغي أن تساوي درجة حرارة التلدين في تفاعل PCR قيمة Tm المحسوبة؟

لا. تبدأ معظم البروتوكولات بدرجات عدة تحت قيمة Tm المحسوبة ثم تضبطها انطلاقًا من ذلك، لأن Tm تحدد النقطة التي يكون عندها نصف البادئ فقط مرتبطًا.

هل يغير طول البادئ قيمة Tm؟

نعم، ولكن ليس بطريقة بسيطة. يظهر الطول في مقام معادلة مارمور-دوتي، ولذلك لا تكون قيمة Tm لبادئ أطول ذي محتوى GC متوسط أعلى تلقائيًا من قيمة Tm لبادئ أقصر غني بـ GC.

لماذا تختلف حاسبات Tm؟

تستخدم هذه الحاسبات معادلات مختلفة. فقد تعطي قاعدة والاس، ومعادلة مارمور-دوتي لمحتوى GC، والديناميكا الحرارية بطريقة الجار الأقرب، والمعادلات المصححة بالملح قيم Tm مختلفة للبادئ نفسه، بفارق قد يبلغ عدة درجات أحيانًا.

المراجع

1. مارمور J، دوتي P. تحديد تركيب قواعد الحمض النووي منقوص الأكسجين من درجة حرارة نزع استبداله الحراري. مجلة البيولوجيا الجزيئية. 1962؛5(1):109-118.
2. والاس RB، شافر J، مورفي RF، بونر J، هيروسي T، إيتاكورا K. تهجين قليلات النيوكليوتيد منزوعة الأكسجين الاصطناعية مع DNA فاي-تشي 174. أبحاث الأحماض النووية. 1979؛6(11):3543-3557.
3. سانتا لوتشيا J الابن. رؤية موحدة للديناميكا الحرارية بطريقة الجار الأقرب للبوليمر وDNA ذي البنية الدمبلية وقليل النيوكليوتيد. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية. 1998؛95(4):1460-1465.