حاسبة تركيز البروتين

تحوّل حاسبة تركيز البروتين قراءة امتصاص الضوء من مقياس الطيف الضوئي إلى كمية البروتين المذاب في محلول. تُعطى النتيجة عادةً بالملليغرام لكل ملليلتر (mg/mL) أو بالميكروغرام لكل ملليلتر (μg/mL). يعتمد الحساب على قانون بير-لامبرت، وهو علاقة في الكيمياء تربط بين مقدار الضوء الذي تمتصه العينة وكمية المادة التي تحتوي عليها.

كيفية قياس تركيز البروتين

تمتص معظم البروتينات الضوء فوق البنفسجي بقوة عند طول موجي قدره 280 نانومتر (nm). وينشأ هذا الامتصاص أساسًا من حمضَي التريبتوفان والتيروزين الأمينيين الموجودين في بنية البروتين. يسلّط مقياس الطيف الضوئي الضوء عبر العينة ويقيس مقدار الضوء الذي تمتصه العينة. تُسمى هذه القراءة الامتصاصية، أو A280 عند أخذها عند 280 nm.

إن قياس الامتصاصية عند 280 nm سريع ولا يتلف العينة. وهذا ما يميّزه عن الطرق الكيميائية مثل اختبار برادفورد أو اختبار BCA الموصوفين أدناه. تعمل الطريقة على أفضل نحو مع بروتين منقّى في محلول، بحيث تتراوح قراءة الامتصاصية تقريبًا بين 0.1 و1.0. وتكون القراءات خارج هذا النطاق أقل موثوقية، لذلك تحتاج العينة غالبًا إلى التخفيف قبل القياس.

معادلة تركيز البروتين

تعيد الحاسبة ترتيب قانون بير-لامبرت لحساب التركيز:

C = (A × DF) / (ε × l)

C — تركيز البروتين، بالملليغرام لكل ملليلتر
A — الامتصاصية عند 280 nm (عدد مجرد بلا وحدة)
DF — عامل التخفيف، أي عدد مرات تخفيف العينة الأصلية قبل قياسها
ε — معامل الانقراض، وهو ثابت خاص بالبروتين، بوحدة L/(g·cm)
l — طول المسار، أي المسافة التي يقطعها الضوء عبر العينة، بالسنتيمتر (وعادةً ما تكون 1 سم في كُوَيْت قياسي، وهو وعاء زجاجي أو بلاستيكي صغير يُستخدم في مقياس الطيف الضوئي)

لتحويل النتيجة إلى ميكروغرام لكل ملليلتر، تُضرب قيمة mg/mL في 1,000. ولإيجاد الكتلة الكلية للبروتين في العينة، يُضرب التركيز في حجم العينة بالملليلتر.

مثال محلول

تعطي عينة قراءة امتصاصية قدرها 0.5 عند 280 nm. ولم تُخفف، لذلك فإن عامل التخفيف هو 1، وقِيست في كُوَيْت قياسي بطول مسار 1 سم. والبروتين هو ألبومين مصل الأبقار (BSA)، الذي يبلغ معامل انقراضه 0.667 لتر/(g·cm).

C = (0.5 × 1) / (0.667 × 1) ≈ 0.75 mg/mL

في عينة حجمها 1 ملتر، تعادل هذه الكمية نحو 0.75 mg من البروتين الكلي، أو 750 μg/mL.

معاملات الانقراض للبروتينات الشائعة

يمتص كل بروتين الضوء بطريقة مختلفة، لأن لكل بروتين عددًا مختلفًا من بقايا التريبتوفان والتيروزين. يصف معامل الانقراض ذلك لبروتين معين عند 280 nm، بوحدات L/(g·cm). ومن القيم الشائعة الاستخدام:

البروتين	معامل الانقراض ε (L/(g·cm))
ألبومين مصل الأبقار (BSA)	0.667
الغلوبولين المناعي G (IgG)	1.38
الليزوزيم	2.64
ألبومين البيض	0.73

يمكن للحاسبة أيضًا قبول معامل انقراض مخصص لبروتين غير مدرج في هذه القائمة. وبالنسبة إلى بروتين معروف التسلسل الحمضي الأميني له، يمكن تقدير هذه القيمة باستخدام معادلة نشرها جيل وفون هيبل عام 1989: ε₂₈₀ = (بقايا التريبتوفان × 5,500) + (بقايا التيروزين × 1,490) + (بقايا السيستين الثنائي × 125). تعطي هذه المعادلة نتيجة بوحدة M⁻¹cm⁻¹، وهي وحدة مولارية تختلف عن قيم L/(g·cm) المعتمدة على الكتلة والمذكورة أعلاه. وتحسب أدوات مجانية مثل ProtParam، التي يستضيفها خادم ExPASy، هذه القيمة مباشرةً من تسلسل البروتين.

طول المسار وعامل التخفيف

طول المسار هو عرض الكُوَيْت الذي يحتوي على العينة، ويُقاس بالسنتيمتر. يبلغ عرض الكُوَيْتات القياسية 1 سم. وقد تستخدم مقاييس الطيف الضوئي ذات الحجم المجهري، التي تقيس عينات صغيرة جدًا، مسارًا أقصر بكثير، مثل 0.1 سم.

يأخذ عامل التخفيف في الحسبان أي تخفيف أُجري قبل القياس. فإذا كانت العينة المركزة ستعطي امتصاصية أعلى من 1.0، فمن المعتاد تخفيفها أولًا باستخدام محلول منظم. ويساوي عامل التخفيف الحجم الكلي المخفف مقسومًا على حجم العينة الأصلية. فعلى سبيل المثال، يؤدي خلط 10 μL من العينة مع 990 μL من المحلول المنظم إلى حجم كلي قدره 1,000 μL، وعامل تخفيف قدره 100.

طرق أخرى لقياس تركيز البروتين

تُعد الامتصاصية عند 280 nm إحدى الطرق الشائعة العديدة المستخدمة في المختبر.

اختبار برادفورد: يستخدم صبغة يتغير لونها عند ارتباطها بالبروتين. ويعمل جيدًا مع العينات غير المنقاة، لكن تغير اللون قد يختلف بين البروتينات المختلفة.
اختبار BCA: يعتمد على تغير لون تسببه الروابط الببتيدية في البروتين. وهو متوافق مع كثير من المنظفات، لكنه يستغرق وقتًا أطول من قراءة الامتصاصية المباشرة.
طريقة لوري: طريقة أقدم شديدة الحساسية، لكنها تتفاعل على نحو ضعيف مع بعض مكونات المحاليل المنظمة الشائعة.

تتلف كل واحدة من هذه الطرق الثلاث العينة. أما القياس المباشر لـ A280 فلا يفعل ذلك، ولذلك يمكن استعادة العينة نفسها واستخدامها مرة أخرى.

الأسئلة الشائعة

ما نطاق الامتصاصية المثالي لهذه الطريقة؟

بين 0.1 و1.0. وتكون القراءة غير دقيقة تحت 0.1. وفوق 1.0، قد لا تعود العلاقة بين الامتصاصية والتركيز خطية، لذلك ينبغي تخفيف العينة أولًا.

لماذا يُقاس عند 280 nm بدلًا من 260 nm؟

تمتص الأحماض النووية، مثل DNA وRNA، الضوء بقوة عند 260 nm. وتمتص البروتينات بدرجة أكبر عند 280 nm بسبب محتواها من التريبتوفان والتيروزين. ويقلل القياس عند 280 nm من التداخل الناتج عن أي أحماض نووية موجودة في العينة.

كيف يُحدَّد معامل الانقراض لبروتين غير مدرج؟

بالنسبة إلى بروتين معروف التسلسل، تحسبه أداة مثل ProtParam من عدد بقايا التريبتوفان والتيروزين والسيستين الثنائي. ويمكن أيضًا قياسه مباشرةً، بمقارنة امتصاصية العينة بمحلول ذي تركيز معروف.

هل تعمل هذه الطريقة مع مزيج من البروتينات؟

تعمل على أفضل نحو مع بروتين واحد منقّى ذي معامل انقراض معروف. أما مزيج البروتينات غير المعروفة، مثل محلول تحلل الخلايا، فيُقاس عادةً باستخدام اختبار برادفورد أو اختبار BCA بدلًا من ذلك، لأن هاتين الطريقتين تعطيان تقديرًا أكثر اتساقًا لكمية البروتين الكلية.

هل يمكن أن تتداخل المنظفات مع القراءة؟

نعم. تمتص منظفات كثيرة الضوء بالقرب من 280 nm، مما قد يشوّه النتيجة. ويساعد استخدام عينة شاهدة تحتوي على التركيز نفسه من المنظف في إلغاء امتصاصية الخلفية تلك. وقد تستدعي التراكيز العالية جدًا من المنظفات استخدام اختبار متوافق مع المنظفات، مثل اختبار BCA، بدلًا من ذلك.

حاسبة تركيز البروتين | A280 إلى ملغ/مل