Калкулатор за броя копия на ДНК | Геномен анализен инструмент

Калкулатор за броя копия на ДНК

Калкулаторът за броя копия на ДНК оценява колко копия на целева последователност има в дадена ДНК проба. Той използва концентрацията и обема на пробата, както и това колко често целевата последователност се среща в по-дългата ДНК последователност. Лабораториите по молекулярна биология използват този тип оценка, за да планират експерименти като qPCR (количествена полимеразна верижна реакция), преди да извършат по-скъп и по-прецизен анализ.

Какво означава броят копия на ДНК

Броят копия на ДНК показва колко пъти дадена специфична последователност се среща в геном или проба. Обичайният човешки ген се среща два пъти — веднъж, унаследен от всеки родител. Няколко фактора могат да променят този брой.

• Амплификация: повече от две копия. Раковите клетки често амплифицират гени, които стимулират растежа, например HER2 в някои тумори на гърдата.
• Делеция: по-малко от две копия, понякога нула. Делециите могат да причинят генетични заболявания.
• Дупликация: появява се допълнително копие там, където трябва да има само едно или две.
• Вариация в броя на копията (CNV): нормална разлика в броя на копията между отделни хора, която се среща в значителна част от човешкия геном.

Формула за броя копия на ДНК

Калкулаторът преобразува броя срещания и масата на пробата в брой копия чрез следната формула:

$\text{Брой копия} = \frac{\text{Брой срещания} \times \text{Концентрация} \times \text{Обем} \times N_A}{\text{Дължина на ДНК} \times 660 \times 10^{9}}$

Където:

• Брой на срещанията — броят на случаите, в които целевата последователност се среща в цялата ДНК последователност, като съвпаденията с припокриване се броят поотделно.
• Концентрация — концентрацията на ДНК в нанограми на микролитър (ng/μL), обикновено измерена със спектрофотометър или флуорометър.
• Обем — обемът на пробата в микролитри (μL).
• $N_A$ — числото на Авогадро, 6,022 × 10²³ молекули на мол. То преобразува количеството ДНК в молове в брой молекули.
• Дължина на ДНК — дължината на пълната ДНК последователност, измерена в двойки бази.
• 660 — средната молекулна маса на една двойка бази в ДНК, в грамове на мол (g/mol). Двойката бази се състои от два сдвоени нуклеотида, по един от всяка ДНК верига.
• 10⁹ — преобразува нанограмите в грамове.

Формулата първо преобразува масата на пробата в молове ДНК молекули, умножава по числото на Авогадро, за да получи общия брой ДНК молекули в пробата, след което умножава по броя пъти, които целевата последователност се среща във всяка молекула.

Инструментът приема само буквите A, T, C и G. Интервалите и новите редове се игнорират, а малките букви се броят по същия начин като главните.

Как се изчислява броят копия на ДНК: пример с решение

Да разгледаме ДНК последователност от 12 двойки бази, ATCGATCGATCG, с целева последователност ATCG, концентрация 10 нг/μL и обем 20 мкл.

Стъпка 1: Бройте срещанията. ATCG се среща 3 пъти в ATCGATCGATCG — на позиции 1, 5 и 9.

Стъпка 2: Намерете общата маса на ДНК. Концентрация × обем = 10 × 20 = 200 нг.

Стъпка 3: Преобразувайте в молове. 200 нг = 2 × 10⁻⁷ g. Разделете на (12 двойки бази × 660 g/mol) = 7 920 g/mol. Получавате 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Стъпка 4: Преобразувайте в брой молекули. Умножете по числото на Авогадро: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ молекули/mol ≈ 1,52 × 10¹³ ДНК молекули.

Стъпка 5: Умножете по броя срещания. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, или приблизително 45 621 212 121 212 копия.

Това число изглежда огромно, защото проба от 20 мкл при 10 нг/μL все още съдържа трилиони къси ДНК молекули. В реални проби обикновено се използват много по-дълги последователности, което намалява броя на молекулите при същата маса.

Къде се използва анализът на броя копия на ДНК

Диагностика на рак. Патологичните лаборатории проверяват броя копия на HER2 в тъкан от тумор на гърдата. Нормалната клетка носи две копия. Амплифицираният тумор може да носи шест или повече, което влияе върху възможността за лечение с таргетни лекарства като трастузумаб.

Изследване за генетични заболявания. Състояния като синдрома на ДиДжордж включват делеция на сегмент от хромозома. Синдромът на Даун включва допълнително копие на хромозома 21 (тризомия 21). Преброяването на копията помага за потвърждаване на тези диагнози.

Количествено определяне на трансгени и плазмиди. Изследователите проверяват колко копия на вмъкнат ген са попаднали в растителна, животинска или бактериална клетка. Обикновено се предпочита едно копие, тъй като множество копия могат да задействат заглушаване на гена от клетката.

Мониторинг на патогени и вирусен товар. Оценките на броя копия проследяват количеството вирусна или бактериална ДНК в проба, което се използва при наблюдение на инфекции и изследване на околната среда.

Други методи за измерване на броя копия

Този калкулатор дава бърза оценка въз основа на данни за последователността и концентрацията. Лабораториите, които се нуждаят от по-голяма прецизност, обикновено използват един от следните методи:

• Количествена PCR (qPCR): амплифицира и измерва ДНК в реално време; при добра стандартна крива точността е приблизително 15–20%.
• Дигитална PCR (dPCR): разделя пробата на хиляди малки реакции за директно преброяване, без да е необходима стандартна крива.
• Флуоресцентна in situ хибридизация (FISH): визуално преброява последователностите под микроскоп директно в клетки или хромозоми; това е стандартният метод в много лаборатории за диагностика на рак.
• Секвениране от ново поколение (NGS): секвенира цялата проба и едновременно определя профила на броя копия в целия геном.

Често задавани въпроси

Какво представлява броят копия на ДНК? Това е броят пъти, в които дадена ДНК последователност се среща в геном или проба. Повечето човешки гени се срещат два пъти — по веднъж от всеки родител. Допълнителните или липсващите копия могат да повлияят на здравето и риска от заболявания.

Колко точен е този калкулатор? Той дава теоретична оценка въз основа на въведените данни, а не лабораторно измерване. Точността зависи от прецизността на измерване на концентрацията и от специфичността на целевата последователност. Методи като дигиталната PCR са по-прецизни за резултати, предназначени за публикуване.

Може ли този калкулатор да се използва за РНК? Не. РНК използва урацил вместо тимин и различна захар, поради което молекулната ѝ маса се различава от тази на ДНК. РНК има средна молекулна маса от около 330 g/mol на нуклеотид, в сравнение с около 660 g/mol на двойка бази в ДНК. Използването на формулата за ДНК с данни за РНК би дало неправилен резултат.

Защо припокриваща се последователност се брои повече от веднъж? Калкулаторът брои всяка позиция, на която целевата последователност съвпада, дори когато съвпаденията споделят букви. В ATATAT последователността ATA съвпада два пъти — на позиция 1 и на позиция 3, тъй като всяка начална позиция се проверява независимо.

Какъв диапазон на концентрацията на ДНК работи най-добре? Концентрации от 10–100 нг/μL дават най-надеждни показания със стандартни лабораторни уреди. Под 10 нг/μL грешката при измерване нараства и вместо стандартен спектрофотометър се препоръчва по-чувствителен метод, например флуорометър.

Може ли този калкулатор да оцени броя копия на плазмид? Да. Въведете пълната последователност на плазмида като ДНК последователност, а уникален участък от вмъкнатия фрагмент като целева последователност, заедно с измерената концентрация на плазмида и обема на пробата.