Калкулатор за температура на свързване на ДНК | Безплатен PCR Tm инструмент

Какво представлява калкулаторът за температура на отгряване на ДНК?

Калкулаторът за температура на отгряване на ДНК изчислява приблизителната температура на топене (Tm) на ДНК праймер по неговата последователност. Tm е температурата, при която половината от молекулите на праймера са свързани с целевата си верига, а другата половина не са. При полимеразна верижна реакция (PCR) тази стойност насочва избора на температурата, при която праймерите се свързват с ДНК матрицата.

Защо температурата на отгряване е важна при PCR

PCR копира целеви участък от ДНК чрез повтарящи се цикли на нагряване и охлаждане. Всеки цикъл има три стъпки. Първо, нагряването разделя двуверижната матрица при около 95 °C. Тази стъпка се нарича денатурация. Второ, реакцията се охлажда до температурата на отгряване, обикновено между 50 °C и 65 °C, така че късите праймери да могат да се свържат с комплементарни последователности върху единичните вериги. Трето, температурата се повишава до около 72 °C и ензим, наречен ДНК полимераза, удължава праймерите, за да изгради нови ДНК вериги.

Ако температурата на отгряване е твърде ниска, праймерите се свързват с последователности, които съвпадат само частично, и се образуват допълнителни нежелани ДНК фрагменти. Ако е твърде висока, праймерите не могат да образуват стабилна връзка с матрицата и се копира малко или никаква ДНК. Температурата на отгряване е една от първите настройки, които изследователите променят, когато PCR реакцията не протича успешно.

Как съдържанието на GC влияе върху Tm

Праймерът се свързва с целевата си последователност чрез водородни връзки. Двойката гуанин–цитозин (G-C) образува три водородни връзки. Двойката аденин–тимин (A-T) образува две. Праймер с повече бази G и C изисква повече топлина за разделяне, затова има по-висока Tm от праймер със същата дължина, но с повече бази A и T. Съдържанието на GC обикновено се изразява като процент: броят на базите G и C, разделен на общата дължина на последователността и умножен по 100.

Формула за температурата на отгряване на ДНК

Този калкулатор прилага една от две формули, избрана според дължината на праймера.

За праймери с 14 нуклеотида или повече се използва формулата на Marmur–Doty за съдържанието на GC:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Тук N_GC е броят на базите G и C в праймера, преброени директно, а не като процент. N е общият брой бази.

За праймери с по-малко от 14 нуклеотида се използва правилото на Wallace:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G и C обозначават съответно броя на базите от всеки тип в праймера.

И двете формули приемат обичайни условия за PCR: около 50 наномола праймер и 50 милимола Na+.

Пример с решение

Да разгледаме праймер с 19 бази ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Дължината му е 19, което е 14 или повече, затова калкулаторът използва формулата на Marmur–Doty.

• Дължина (N) = 19
• Брой G = 5, брой C = 5, следователно N_GC = 10, а съдържанието на GC е 10 / 19 × 100 ≈ 52,6%
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

Формулата използва броя на GC, 10, а не процента GC, 52,6. Погрешното използване на процента дава Tm около 143 °C, което не е реалистична стойност за PCR реакция, протичаща между 50 °C и 95 °C.

Как се използва този калкулатор

Въведете или поставете последователност на праймер, като използвате само буквите A, T, G и C. Калкулаторът показва дължината на последователността в нуклеотиди (nt), съдържанието на GC като процент и изчислената температура на отгряване в градуси по Целзий. Резултатът може да се копира за лабораторни бележки или протокол.

Избор на температура на отгряване при PCR

Tm е изчислена приблизителна стойност, а не гарантирана работна температура. При много PCR протоколи действителната стъпка на отгряване започва няколко градуса под изчислената Tm, след което температурата се коригира според резултата върху гел. При двойка праймери като начална точка обикновено се използва по-ниската от двете стойности на Tm. Градиентната PCR, при която едновременно се провеждат няколко реакции в диапазон от температури, е често използван начин за намиране на най-подходящата температура чрез изпитване.

Други начини за изчисляване на Tm

Използваните тук формули на Marmur–Doty и Wallace са бързи приближения, основани само на базовия състав. Съществуват и други методи:

• Термодинамичният модел на най-близките съседи отчита как всяка двойка съседни бази влияе върху стабилността и се смята за по-точния метод за стандартни праймери.
• Формулите с корекция за солевия ефект добавят поправка за концентрацията на йони Na+ или K+ в реакционния буфер, тъй като по-високата концентрация на сол стабилизира двуверижната ДНК и повишава Tm.

Различни калкулатори могат да отчетат различни стойности на Tm за един и същ праймер, защото използват различни формули. Провеждането на PCR и проверката на резултата остават окончателният тест.

Често задавани въпроси

Какво представлява температурата на отгряване на ДНК?

Това е температурата, при която ДНК праймерите се свързват с комплементарната си последователност върху матричната верига по време на PCR. В лабораториите обикновено я задават няколко градуса под изчислената температура на топене (Tm) на праймера.

Как се изчислява Tm на праймера?

За праймери с 14 бази или повече Tm = 64,9 + 41 × (брой GC − 16,4) / дължина. За праймери с по-малко от 14 бази Tm = 2 × (брой A+T) + 4 × (брой G+C).

Защо съдържанието на GC повишава Tm?

Двойките бази G-C образуват три водородни връзки, в сравнение с две при двойките A-T. Праймер с по-голям дял бази G и C изисква повече енергия, а следователно и по-висока температура, за да се отдели от целевата си последователност.

Трябва ли температурата на отгряване при PCR да е равна на изчислената Tm?

Не. При повечето протоколи се започва няколко градуса под изчислената Tm и оттам се правят корекции, тъй като Tm обозначава точката, при която е свързана само половината от праймера.

Променя ли дължината на праймера Tm?

Да, макар и не по прост начин. Дължината е в знаменателя на формулата на Marmur–Doty, затова по-дълъг праймер със средно съдържание на GC не получава автоматично по-висока Tm от по-къс, богат на GC праймер.

Защо различните калкулатори на Tm дават различни резултати?

Те използват различни формули. Правилото на Wallace, формулата на Marmur–Doty за съдържанието на GC, термодинамиката на най-близките съседи и формулите с корекция за солевия ефект могат да дадат различна Tm за един и същ праймер, понякога с разлика от няколко градуса.

Източници

1. Marmur J, Doty P. Определяне на базовия състав на дезоксирибонуклеиновата киселина по температурата на термичната ѝ денатурация. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Хибридизация на синтетични олигодезоксирибонуклеотиди с phi chi 174 ДНК. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. Единен поглед върху термодинамиката на най-близките съседи при полимерна, двуспирална и олигонуклеотидна ДНК. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.