Calculadora de Dilució Cel·lular

Una calculadora de dilució cel·lular determina quina quantitat de suspensió cel·lular i de diluent cal barrejar per assolir una concentració cel·lular objectiu en un volum final determinat. S'utilitza en cultius cel·lulars, microbiologia i altres tasques de laboratori en què cal ajustar una mostra a una concentració exacta abans d'utilitzar-la.

Què significa diluir cèl·lules

Diluir una suspensió cel·lular no modifica el nombre de cèl·lules que conté. Només modifica el volum en què es troben les cèl·lules, cosa que en redueix la concentració. Una suspensió amb una concentració de 1.000.000 cèl·lules per mil·lilitre (cèl·lules/mL) continua contenint el mateix nombre total de cèl·lules després de la dilució. Aquest nombre simplement queda repartit en una quantitat més gran de líquid.

Els laboratoris dilueixen les cèl·lules abans de moltes tasques rutinàries: dividir un cultiu en creixement en matrassos nous, sembrar un nombre fix de cèl·lules a cada pou d'una placa, congelar cèl·lules per emmagatzemar-les o preparar una mostra per a un comptador cel·lular o un citòmetre de flux.

Fórmula de la dilució cel·lular

El càlcul es basa en una regla. El nombre de cèl·lules preses de la suspensió inicial, multiplicat per la seva concentració, ha de ser igual al nombre de cèl·lules del volum final, multiplicat per la concentració objectiu:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

C₁ — concentració inicial (de reserva), en cèl·lules/mL
V₁ — volum de la suspensió inicial que cal utilitzar, en mL
C₂ — concentració objectiu, en cèl·lules/mL
V₂ — volum final total necessari, en mL

Si es resol per a V₁, s'obté el volum de suspensió inicial que cal pipetejar:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

La resta del volum final és diluïent, habitualment medi de cultiu cel·lular, solució salina tamponada amb fosfat (PBS) o un altre tampó:

Volum de diluïent = V₂ − V₁

La concentració objectiu (C₂) no pot ser mai superior a la concentració inicial (C₁). La dilució només redueix la concentració. Per augmentar-la, cal centrifugar les cèl·lules i ressuspendre-les en una quantitat menor de líquid.

Com calcular una dilució cel·lular

Compteu la suspensió inicial amb un hemocitòmetre o un comptador cel·lular automàtic per obtenir C₁.
Anoteu la concentració objectiu, C₂, que requereix el protocol.
Determineu el volum final total, V₂, necessari.
Calculeu V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
Calculeu el volum de diluïent com V₂ − V₁.
Pipetegeu V₁ de la suspensió inicial en un tub i, a continuació, afegiu-hi el volum de diluïent de medi o tampó.

Exemple resolt

Una suspensió inicial presenta una concentració de 1.000.000 cèl·lules/mL. Un protocol requereix 100.000 cèl·lules/mL en un volum final de 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100.000 × 10) ÷ 1.000.000 = 1.000.000 ÷ 1.000.000 = 1 mL

Volum de diluïent = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Agafar 1 mL de la suspensió inicial i afegir-hi 9 mL de medi dona 10 mL de suspensió a 100.000 cèl·lules/mL.

Un segon exemple

Un assaig en una placa de 96 pous necessita 10.000 cèl·lules per pou en 200 microlitres (μL) de medi per pou. Això correspon a una concentració objectiu de 50.000 cèl·lules/mL, ja que 10.000 cèl·lules dividides per 0,2 mL equivalen a 50.000 cèl·lules/mL. La suspensió inicial presenta 2.000.000 cèl·lules/mL, i cal un total de 20 mL per cobrir la placa, amb una quantitat addicional per compensar les pèrdues de pipeteig.

V₁ = (50.000 × 20) ÷ 2.000.000 = 1.000.000 ÷ 2.000.000 = 0,5 mL

Volum de diluïent = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Barrejar 0,5 mL de la suspensió inicial amb 19,5 mL de medi dona 20 mL a 50.000 cèl·lules/mL, una dilució d'1 en 40.

Fonts d'error

La fórmula en si és exacta. Els errors provenen dels nombres que s'hi introdueixen.

Error de recompte. Un recompte cel·lular incorrecte es tradueix directament en una dilució incorrecta. Comptar els quatre quadrats de les cantonades de la quadrícula de l'hemocitòmetre i fer-ne la mitjana redueix aquest risc.
Cèl·lules agrupades. Un grup de cèl·lules sembla una sola cèl·lula al microscopi, però en realitat en conté diverses, de manera que redueix la concentració aparent.
Interval de la pipeta. Una pipeta utilitzada fora del seu interval de volum especificat dona resultats inexactes. Una pipeta de 1000 μL ajustada per dispensar 5 μL no és fiable; cal utilitzar una pipeta més petita.
Confusió d'unitats. Barrejar cèl·lules/mL amb cèl·lules/μL produeix un error mil vegades massa gran o massa petit.
Cèl·lules mortes. Un recompte cel·lular directe inclou les cèl·lules mortes si no s'ha utilitzat un colorant de viabilitat, com el blau de tripà. Això pot sobreestimar el nombre de cèl·lules vives realment presents.

Límits d’aquesta calculadora

La calculadora rebutja els nombres que no permeten obtenir una resposta útil:

Tots els valors han de ser superiors a zero.
La concentració objectiu no pot ser superior a la concentració inicial.
La concentració inicial ha de ser de 1 bilió de cèl·lules/mL (1 × 10¹²) o inferior.
El volum de suspensió inicial calculat ha de ser com a mínim de 0,001 mL, que equival a 1 microlitre. Qualsevol volum inferior no es pot pipetejar amb precisió, de manera que la calculadora demana altres valors. Augmentar el volum total sol resoldre el problema.

Els volums es mostren amb dues xifres decimals, o amb tres quan el volum de suspensió inicial és inferior a 0,01 mL, de manera que un volum petit mai no apareix com 0,00 mL.

Preguntes més freqüents

Quina és la fórmula de la dilució cel·lular?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, on C₁ i C₂ són les concentracions inicial i objectiu, i V₁ i V₂ són el volum extret de la suspensió inicial i el volum final total.

La concentració objectiu pot ser superior a la concentració inicial?

No. La dilució només redueix la concentració. Per assolir una concentració més alta, cal centrifugar les cèl·lules i ressuspendre-les en un volum menor.

Quin líquid s'ha d'utilitzar per diluir les cèl·lules?

S'utilitza medi de cultiu complet quan les cèl·lules han de mantenir-se sanes durant hores o dies, com abans de sembrar una placa. El PBS o una solució salina tamponada similar és adequada per a dilucions breus, de menys d'aproximadament 30 minuts, abans de continuar processant les cèl·lules. S'utilitza medi sense sèrum quan les proteïnes del sèrum podrien interferir en un assaig posterior.

Aquesta fórmula funciona per a bacteris o llevats?

Sí. C₁V₁ = C₂V₂ s'aplica a qualsevol suspensió de partícules, inclosos els bacteris mesurats en unitats formadores de colònies per mil·lilitre (UFC/mL), els llevats i les partícules víriques mesurades en unitats formadores de plaques per mil·lilitre (UFP/mL), sempre que s'utilitzin les mateixes unitats als dos costats de l'equació.

S'han de comptar les cèl·lules mortes en la dilució?

Per sembrar un cultiu viu, només s'han de comptar les cèl·lules viables. Si una suspensió té una viabilitat del 80 %, la seva concentració viable és 0,8 vegades el recompte cel·lular total, i aquesta concentració viable s'ha d'utilitzar com a C₁.

Com es poden fer amb precisió dilucions molt grans?

Les dilucions grans, com ara 1 en 1000, se solen fer com una sèrie de passos més petits anomenats dilucions seriades. Tres dilucions successives d'1 en 10 donen una dilució global d'1 en 1000, mantenint cada pas de pipeteig dins d'un interval de volum precís.

Calculadora de Dilució Cel·lular - Eina Precisa de Dilució de Laboratori