Calculadora de Concentració de Proteïnes | A280 a mg/mL

Calculadora de concentració de proteïnes

Una calculadora de concentració de proteïnes converteix una lectura d’absorbància de la llum d’un espectrofotòmetre en la quantitat de proteïna dissolta en una solució. El resultat sol expressar-se en mil·ligrams per mil·lilitre (mg/mL) o micrograms per mil·lilitre (μg/mL). El càlcul es basa en la llei de Beer-Lambert, una relació química que vincula la quantitat de llum absorbida per una mostra amb la quantitat d’una substància que conté.

Com es mesura la concentració de proteïnes

La majoria de proteïnes absorbeixen intensament la llum ultraviolada a una longitud d’ona de 280 nanòmetres (nm). Aquesta absorció prové principalment de dos aminoàcids, el triptòfan i la tirosina, presents en l’estructura de la proteïna. Un espectrofotòmetre fa passar llum a través de la mostra i mesura quanta llum absorbeix la mostra. Aquesta lectura s’anomena absorbància, o A280 quan es pren a 280 nm.

Mesurar l’absorbància a 280 nm és ràpid i no destrueix la mostra. Això la diferencia dels mètodes químics, com els assaigs de Bradford o BCA, descrits més avall. El mètode funciona millor amb una proteïna purificada en solució, amb una lectura d’absorbància entre aproximadament 0,1 i 1,0. Les lectures fora d’aquest interval són menys fiables, de manera que sovint cal diluir la mostra abans de mesurar-la.

Fórmula de la concentració de proteïnes

La calculadora reordena la llei de Beer-Lambert per resoldre la concentració:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — concentració de proteïna, en mg/mL
• A — absorbància a 280 nm (un nombre sense dimensions, sense unitat)
• DF — factor de dilució, el nombre de vegades que es va diluir la mostra original abans de mesurar-la
• ε — coeficient d’extinció, una constant específica de la proteïna, en L/(g·cm)
• l — longitud del recorregut òptic, la distància que recorre la llum a través de la mostra, en cm (habitualment 1 cm en una cubeta estàndard, un recipient petit de vidre o plàstic que s’utilitza en l’espectrofotòmetre)

Per convertir el resultat en micrograms per mil·lilitre, multipliqueu el valor en mg/mL per 1.000. Per trobar la massa total de proteïna de la mostra, multipliqueu la concentració pel volum de la mostra en mil·lilitres.

Exemple resolt

Una mostra dona una lectura d’absorbància de 0,5 a 280 nm. No es va diluir, de manera que el factor de dilució és 1, i es va mesurar en una cubeta estàndard de 1 cm. La proteïna és l’albúmina sèrica bovina (BSA), que té un coeficient d’extinció de 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

En una mostra d’1 mL, això correspon aproximadament a 0,75 mg de proteïna total, o 750 μg/mL.

Coeficients d’extinció de proteïnes comunes

Cada proteïna absorbeix la llum de manera diferent, perquè cadascuna té un nombre diferent de residus de triptòfan i tirosina. El coeficient d’extinció descriu aquest comportament per a una proteïna específica a 280 nm, en unitats de L/(g·cm). Alguns valors d’ús habitual són:

Una calculadora també pot acceptar un coeficient d’extinció personalitzat per a una proteïna que no aparegui en aquesta llista. Per a una proteïna amb una seqüència d’aminoàcids coneguda, aquest valor es pot estimar amb una fórmula publicada per Gill i von Hippel el 1989: ε₂₈₀ = (residus de triptòfan × 5.500) + (residus de tirosina × 1.490) + (residus de cistina × 125). Aquesta fórmula dona un resultat en M⁻¹cm⁻¹, una unitat molar, diferent dels valors basats en la massa expressats en L/(g·cm) anteriors. Eines gratuïtes com ProtParam, allotjada al servidor ExPASy, calculen aquest valor directament a partir d’una seqüència proteica.

Longitud del recorregut òptic i factor de dilució

La longitud del recorregut òptic és l’amplada de la cubeta que conté la mostra, mesurada en centímetres. Les cubetes estàndard tenen una amplada de 1 cm. Els espectrofotòmetres de microvolum, que mesuren mostres molt petites, poden utilitzar un recorregut molt més curt, com ara 0,1 cm.

El factor de dilució té en compte qualsevol dilució efectuada abans de la mesura. Si una mostra concentrada donaria una absorbància superior a 1,0, és habitual diluir-la primer amb un tampó. El factor de dilució és igual al volum total diluït dividit pel volum de la mostra original. Per exemple, barrejar 10 μL de mostra amb 990 μL de tampó dona un volum total de 1.000 μL i un factor de dilució de 100.

Altres maneres de mesurar la concentració de proteïnes

L’absorbància a 280 nm és un dels diversos mètodes habituals que s’utilitzen al laboratori.

• Assaig de Bradford: utilitza un colorant que canvia de color quan s’uneix a la proteïna. Funciona bé amb mostres no purificades, però el canvi de color pot variar entre proteïnes diferents.
• Assaig de BCA: es basa en un canvi de color causat pels enllaços peptídics de la proteïna. És compatible amb molts detergents, però tarda més a completar-se que una lectura directa de l’absorbància.
• Mètode de Lowry: un mètode més antic, molt sensible, però que reacciona malament amb alguns components habituals dels tampons.

Cadascun d’aquests tres mètodes destrueix la mostra. Una mesura directa d’A280 no ho fa, de manera que la mateixa mostra es pot recuperar i tornar a utilitzar.

Preguntes freqüents

Quin és l’interval d’absorbància ideal per a aquest mètode?

Entre 0,1 i 1,0. Per sota de 0,1, la lectura és imprecisa. Per sobre de 1,0, la relació entre l’absorbància i la concentració pot deixar de ser lineal, de manera que primer cal diluir la mostra.

Per què es mesura a 280 nm en lloc de 260 nm?

Els àcids nucleics, com l’ADN i l’ARN, absorbeixen intensament a 260 nm. Les proteïnes absorbeixen més a 280 nm a causa del seu contingut de triptòfan i tirosina. Mesurar a 280 nm redueix la interferència dels àcids nucleics presents a la mostra.

Com es troba el coeficient d’extinció d’una proteïna que no apareix a la llista?

Per a una proteïna amb una seqüència coneguda, una eina com ProtParam el calcula a partir del nombre de residus de triptòfan, tirosina i cistina. També es pot mesurar directament comparant l’absorbància de la mostra amb la d’una solució de concentració coneguda.

Funciona aquest mètode amb una mescla de proteïnes?

Funciona millor amb una sola proteïna purificada amb un coeficient d’extinció conegut. Una mescla de proteïnes desconegudes, com ara un lisat cel·lular, se sol mesurar amb l’assaig de Bradford o BCA, ja que aquests mètodes donen una estimació més coherent de la proteïna total.

Els detergents poden interferir amb la lectura?

Sí. Molts detergents absorbeixen la llum a prop de 280 nm, cosa que pot distorsionar el resultat. L’ús d’una mostra en blanc que contingui la mateixa concentració de detergent ajuda a cancel·lar aquesta absorbància de fons. Les concentracions molt elevades de detergent poden requerir un assaig compatible amb detergents, com ara el BCA.