Celledilutionsberegner - Nøjagtig laboratorie-fortyndningsværktøj

Beregner til cellefortynding

En beregner til cellefortynding finder ud af, hvor meget cellesuspension og hvor meget fortyndingsvæske der skal blandes for at nå en bestemt cellekoncentration i et valgt slutvolumen. Den bruges i cellekultur, mikrobiologi og andet laboratoriearbejde, hvor en prøve skal bringes op på en nøjagtig koncentration før brug.

Hvad cellefortynding betyder

Fortynding af en cellesuspension ændrer ikke, hvor mange celler den indeholder. Den ændrer kun det volumen, cellerne befinder sig i, og dermed sænkes koncentrationen. En suspension, der er talt til 1.000.000 celler pr. milliliter (celler/mL), indeholder stadig det samme samlede antal celler efter fortynding. Antallet er blot fordelt i mere væske.

Laboratorier fortynder celler før mange rutinemæssige trin: når en voksende kultur fordeles i nye kolber, når et bestemt antal celler udsås i hver brønd i en plade, når celler nedfryses til opbevaring, eller når en prøve forberedes til en celletæller eller et flowcytometer.

Formel for cellefortynding

Beregningen bygger på én regel. Antallet af celler fra stamsuspensionen, multipliceret med dens koncentration, skal være lig med antallet af celler i slutvolumenet, multipliceret med målkoncentrationen:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — udgangskoncentration (stamkoncentration), i celler/mL
• V₁ — volumen af stamsuspension, der skal bruges, i mL
• C₂ — målkoncentration, i celler/mL
• V₂ — nødvendigt samlet slutvolumen, i mL

Når man løser ligningen for V₁, fås den volumen af stamsuspension, der skal pipetteres:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Resten af slutvolumenet er fortyndingsvæske, som normalt er cellekulturmedium, fosfatbufret saltvand (PBS) eller en anden buffer:

Fortyndingsvæskens volumen = V₂ − V₁

Målkoncentrationen (C₂) kan aldrig være højere end stamkoncentrationen (C₁). Fortynding sænker kun koncentrationen. Hvis den skal øges, kræver det, at cellerne centrifugeres ned og resuspenderes i mindre væske.

Sådan beregnes en cellefortynding

1. Tæl stamsuspensionen med et hæmocytometer eller en automatisk celletæller for at få C₁.
2. Notér den målkoncentration, C₂, som protokollen kræver.
3. Fastlæg det nødvendige samlede slutvolumen, V₂.
4. Beregn V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
5. Beregn fortyndingsvæskens volumen som V₂ − V₁.
6. Pipettér V₁ stamsuspension i et rør, og tilsæt derefter den beregnede volumen medium eller buffer som fortyndingsvæske.

Regneeksempel

En stamsuspension er talt til 1.000.000 celler/mL. En protokol kræver 100.000 celler/mL i et slutvolumen på 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100.000 × 10) ÷ 1.000.000 = 1.000.000 ÷ 1.000.000 = 1 mL

Fortyndingsvæskens volumen = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Ved at tage 1 mL stamsuspension og tilsætte 9 mL medium fås 10 mL suspension med 100.000 celler/mL.

Et andet eksempel

Et assay i en plade med 96 brønde kræver 10.000 celler pr. brønd i 200 mikroliter (μL) medium pr. brønd. Det svarer til en målkoncentration på 50.000 celler/mL, eftersom 10.000 celler divideret med 0,2 mL er lig med 50.000 celler/mL. Stamsuspensionen er talt til 2.000.000 celler/mL, og der kræves i alt 20 mL for at dække pladen med lidt ekstra til pipetteringstab.

V₁ = (50.000 × 20) ÷ 2.000.000 = 1.000.000 ÷ 2.000.000 = 0,5 mL

Fortyndingsvæskens volumen = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Blanding af 0,5 mL stamsuspension med 19,5 mL medium giver 20 mL med 50.000 celler/mL, en fortynding på 1 i 40.

Fejlkilder

Selve formlen er nøjagtig. Fejl skyldes de tal, der sættes ind i den.

• Tællefejl. En forkert celletælling føres direkte videre til en forkert fortynding. Hvis man tæller flere felter på hæmocytometeret og tager gennemsnittet af dem, mindskes denne risiko.
• Sammenklumpede celler. En celleklump ser ud som én celle i et mikroskop, men består i virkeligheden af flere celler, så den tilsyneladende koncentration bliver for lav.
• Pipettens volumenområde. En pipette, der bruges uden for dens angivne volumenområde, giver unøjagtige resultater. En 1000 μL-pipette indstillet til at dispensere 5 μL er ikke pålidelig; i stedet bør der bruges en mindre pipette.
• Enhedsforveksling. Hvis celler/mL blandes sammen med celler/μL, bliver fejlen tusind gange for stor eller for lille.
• Døde celler. En rå celletælling omfatter døde celler, medmindre der er brugt en viabilitetsfarvning, f.eks. trypanblåt. Det kan overvurdere antallet af levende celler, der faktisk er til stede.

Ofte stillede spørgsmål

Hvad er formlen for cellefortynding?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, hvor C₁ og C₂ er udgangs- og målkoncentrationerne, og V₁ og V₂ er den volumen, der tages fra stamsuspensionen, og den samlede slutvolumen.

Kan målkoncentrationen være højere end udgangskoncentrationen?

Nej. Fortynding sænker kun koncentrationen. En højere koncentration kræver, at cellerne centrifugeres og resuspenderes i et mindre volumen.

Hvilken væske skal bruges til at fortynde celler?

Komplet kulturmedium bruges, når cellerne skal forblive sunde i timer eller dage, f.eks. før en plade besås. PBS eller en tilsvarende bufret saltopløsning fungerer til korte fortyndinger på under cirka 30 minutter, før cellerne behandles videre. Serumfrit medium bruges, når serumproteiner ville forstyrre et efterfølgende assay.

Virker denne formel for bakterier eller gær?

Ja. C₁V₁ = C₂V₂ gælder for enhver suspension af partikler, herunder bakterier målt i kolonidannende enheder pr. milliliter (CFU/mL), gær og viruspartikler målt i plaque-dannende enheder pr. milliliter (PFU/mL), så længe de samme enheder bruges på begge sider af ligningen.

Skal døde celler tælles med i fortyndingen?

Ved udsåning af en levende kultur bør kun levedygtige celler tælles med. Hvis en suspension har en levedygtighed på 80 %, er dens levedygtige koncentration 0,8 gange det samlede celletal, og denne levedygtige koncentration skal bruges som C₁.

Hvordan kan meget store fortyndinger fremstilles nøjagtigt?

Store fortyndinger, f.eks. 1-i-1000, fremstilles normalt som en række mindre trin kaldet seriefortyndinger. Tre successive 1-i-10-fortyndinger giver samlet en 1-i-1000-fortynding, samtidig med at hvert pipetteringstrin holdes inden for et nøjagtigt volumenområde.

Referencer

1. University of Virginia School of Medicine, Department of Otolaryngology. Cell Counting using Hemocytometer. UVA's hæmocytometerprotokol (PDF) — tæl celler i flere store felter og tag gennemsnittet; tællingerne bruges til passage, nedfrysning og udsåning.
2. Current Protocols in Immunology (via PubMed Central). Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability (Strober). PMC6716531 — levedygtige celler har klar cytoplasma, og ikke-levedygtige celler har blå cytoplasma.