Protein Koncentrationsberegner | A280 til mg/mL

Beregner for proteinkoncentration

En beregner for proteinkoncentration omdanner en måling af lysabsorbans fra et spektrofotometer til mængden af protein opløst i en opløsning. Resultatet angives normalt i milligram pr. milliliter (mg/mL) eller mikrogram pr. milliliter (μg/mL). Beregningen er baseret på Beer-Lamberts lov, en sammenhæng i kemien, der forbinder, hvor meget lys en prøve absorberer, med hvor meget af et stof den indeholder.

Sådan måles proteinkoncentration

De fleste proteiner absorberer ultraviolet lys kraftigt ved en bølgelængde på 280 nanometer (nm). Denne absorption skyldes hovedsageligt to aminosyrer, tryptofan og tyrosin, som findes i proteinets struktur. Et spektrofotometer sender lys gennem prøven og måler, hvor meget af lyset prøven absorberer. Denne måling kaldes absorbans eller A280, når den foretages ved 280 nm.

Måling af absorbans ved 280 nm er hurtig og ødelægger ikke prøven. Det adskiller metoden fra kemiske metoder som Bradford- eller BCA-assayet, der beskrives nedenfor. Metoden fungerer bedst for et oprenset protein i opløsning med en absorbansmåling mellem cirka 0,1 og 1,0. Målinger uden for dette interval er mindre pålidelige, så en prøve skal ofte fortyndes før målingen.

Formel for proteinkoncentration

Beregneren omarrangerer Beer-Lamberts lov for at bestemme koncentrationen:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — proteinkoncentration i mg/mL
• A — absorbans ved 280 nm (et tal uden enhed)
• DF — fortyndingsfaktor, hvor mange gange den oprindelige prøve blev fortyndet før målingen
• ε — ekstinktionskoefficient, en konstant, der er specifik for proteinet, i L/(g·cm)
• l — optisk vejlængde, den afstand lyset bevæger sig gennem prøven, i cm (normalt 1 cm i en standardkuvette, en lille beholder af glas eller plast, der bruges i spektrofotometeret)

Resultatet omregnes til mikrogram pr. milliliter ved at gange værdien i mg/mL med 1.000. Den samlede proteinmasse i prøven findes ved at gange koncentrationen med prøvens volumen i milliliter.

Regneeksempel

En prøve giver en absorbansmåling på 0,5 ved 280 nm. Den blev ikke fortyndet, så fortyndingsfaktoren er 1, og den blev målt i en standardkuvette på 1 cm. Proteinet er bovint serumalbumin (BSA), som har en ekstinktionskoefficient på 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

I en prøve på 1 mL svarer det til cirka 0,75 mg samlet protein eller 750 μg/mL.

Ekstinktionskoefficienter for almindelige proteiner

Hvert protein absorberer lys forskelligt, fordi hvert protein har et forskelligt antal tryptofan- og tyrosinrester. Ekstinktionskoefficienten beskriver dette for et bestemt protein ved 280 nm i enheden L/(g·cm). Almindeligt anvendte værdier omfatter:

En beregner kan også acceptere en brugerdefineret ekstinktionskoefficient for et protein, der ikke står på denne liste. For et protein med en kendt aminosyresekvens kan værdien estimeres med en formel offentliggjort af Gill og von Hippel i 1989: ε₂₈₀ = (rester af tryptofan × 5.500) + (rester af tyrosin × 1.490) + (rester af cystin × 125). Formlen giver et resultat i M⁻¹cm⁻¹, en molær enhed, som adskiller sig fra de massebaserede værdier i L/(g·cm) ovenfor. Gratis værktøjer som ProtParam, der hostes af ExPASy-serveren, beregner denne værdi direkte ud fra en proteinsekvens.

Lysvejlængde og fortyndingsfaktor

Lysvejlængden er bredden af den kuvette, som indeholder prøven, målt i centimeter. Standardkuvetter er 1 cm brede. Mikrovolumenspektrofotometre, der måler meget små prøver, kan anvende en meget kortere lysvej, f.eks. 0,1 cm.

Fortyndingsfaktoren tager højde for enhver fortynding, der er udført før målingen. Hvis en koncentreret prøve ville give en absorbans over 1,0, er det almindeligt først at fortynde den med buffer. Fortyndingsfaktoren er lig med det samlede fortyndede volumen divideret med den oprindelige prøvevolumen. Hvis 10 μL prøve blandes med 990 μL buffer, giver det f.eks. et samlet volumen på 1.000 μL og en fortyndingsfaktor på 100.

Andre måder at måle proteinkoncentration på

Absorbans ved 280 nm er en af flere almindelige metoder, der anvendes i laboratoriet.

• Bradford-assay: anvender et farvestof, der skifter farve, når det binder sig til protein. Metoden fungerer godt på uoprensede prøver, men farveændringen kan variere mellem forskellige proteiner.
• BCA-assay: bygger på en farveændring, der skyldes proteinets peptidbindinger. Det er kompatibelt med mange detergenter, men tager længere tid at udføre end en direkte absorbansmåling.
• Lowry-metoden: en ældre metode, der er meget følsom, men reagerer dårligt med nogle almindelige bufferkomponenter.

Alle disse tre metoder ødelægger prøven. En direkte A280-måling gør ikke, så den samme prøve kan genvindes og bruges igen.

Ofte stillede spørgsmål

Hvad er det ideelle absorbansområde for denne metode?

Mellem 0,1 og 1,0. Under 0,1 er målingen upræcis. Over 1,0 er sammenhængen mellem absorbans og koncentration muligvis ikke længere lineær, så prøven bør fortyndes først.

Hvorfor måle ved 280 nm i stedet for 260 nm?

Nukleinsyrer som DNA og RNA absorberer kraftigt ved 260 nm. Proteiner absorberer mere ved 280 nm på grund af deres indhold af tryptofan og tyrosin. Måling ved 280 nm mindsker interferens fra eventuelle nukleinsyrer i prøven.

Hvordan findes ekstinktionskoefficienten for et protein, der ikke står på listen?

For et protein med en kendt sekvens beregner et værktøj som ProtParam den ud fra antallet af tryptofan-, tyrosin- og cystinrester. Den kan også måles direkte ved at sammenligne prøvens absorbans med en opløsning med kendt koncentration.

Fungerer denne metode for en blanding af proteiner?

Den fungerer bedst for et enkelt, oprenset protein med en kendt ekstinktionskoefficient. En blanding af ukendte proteiner, f.eks. et cellelysat, måles normalt i stedet med Bradford- eller BCA-assay, fordi disse metoder giver et mere ensartet estimat af den samlede proteinmængde.

Kan detergenter forstyrre målingen?

Ja. Mange detergenter absorberer lys nær 280 nm, hvilket kan forvrænge resultatet. Brug af en blindprøve med samme detergentkoncentration hjælper med at udligne denne baggrundsabsorbans. Meget høje detergentkoncentrationer kan gøre det nødvendigt at anvende et detergentkompatibelt assay, f.eks. BCA.