Beer-Lambert Lov Beregner - Beregn Absorbans Øjeblikkeligt

Hvad er Beer-Lamberts lov?

Beer-Lamberts lov er en formel, der beskriver, hvor meget lys en opløsning absorberer. Den forbinder absorbansen med tre ting: hvor koncentreret opløsningen er, hvor kraftigt det opløste stof absorberer lys, og hvor langt lyset bevæger sig gennem prøven. Den kaldes også Beers lov. En Beer-Lambert-beregner anvender denne formel til at finde absorbans, transmission og procentdelen af absorberet lys ud fra nogle få enkle input.

Loven er et centralt værktøj inden for spektroskopi, som er studiet af, hvordan stof absorberer og udsender lys. Den bruges dagligt i kemi-, biologi- og medicinske laboratorier til at måle koncentrationen af stoffer i en opløsning.

Formel for Beer-Lamberts lov

Beer-Lamberts lov lyder:

$A = \varepsilon \times c \times l$

• A er absorbansen, altså den mængde lys en opløsning absorberer ved en given bølgelængde. Den har ingen enhed.
• ε (epsilon) er den molare absorptionskoefficient, også kaldet den molare ekstinktionskoefficient. Den måler, hvor kraftigt et stof absorberer lys ved en bestemt bølgelængde. Enhed: L/(mol·cm).
• c er stoffets koncentration i mol/L (molaritet).
• l er den optiske vejlængde, altså den afstand lyset bevæger sig gennem prøven, i cm.

Absorbansen hænger sammen med transmissionen, den brøkdel af lyset der passerer gennem prøven:

$A = -\log_{10}(T)$

$T = 10^{-A}$

Her er T transmissionen, et tal mellem 0 og 1. Når T multipliceres med 100, fås procentdelen af transmitteret lys. Procentdelen af absorberet lys er:

$\text{Procent absorberet} = (1 - T) \times 100\%$

For eksempel betyder en absorbans på 1,0, at T = 0,1, så 90 % af lyset blev absorberet. En absorbans på 2,0 betyder, at T = 0,01, så 99 % blev absorberet.

Sådan beregnes absorbans

For at finde absorbansen med beregneren skal du indtaste tre værdier:

1. Optisk vejlængde (l) — prøvebeholderens bredde, normalt en kuvette. De fleste standardkuvetter er 1 cm brede, mens nogle specialkuvetter er 0,1 cm eller 10 cm brede.
2. Molar absorptionskoefficient (ε) — en egenskab ved det specifikke stof ved en bestemt bølgelængde. Den findes normalt i offentliggjorte referencetabeller eller beregnes ud fra et molekyles struktur. Proteiner absorberer for eksempel lys omkring 280 nm på grund af to aminosyrer, tryptofan og tyrosin, og den nøjagtige værdi afhænger af, hvor mange af disse aminosyrer proteinet indeholder.
3. Koncentration (c) — mængden af opløst stof i mol/L. Koncentrationer angivet i andre enheder, f.eks. mg/mL, skal først omregnes ved hjælp af molekylets molarmasse.

Beregneren multiplicerer de tre tal for at få absorbansen og udleder derefter transmissionen og procentdelen af absorberet lys ud fra resultatet.

Regneeksempel

En forsker oprenser et protein og skal kontrollere dets koncentration, før et eksperiment udføres. Proteinets molare absorptionskoefficient ved 280 nm er kendt ud fra dets sekvens: ε = 44.000 L/(mol·cm). Forskeren måler prøven i en standardkuvette på 1 cm og aflæser en absorbans på A = 0,523.

Omskrivning af formlen for at løse for koncentrationen:

$c = \frac{A}{\varepsilon \times l} = \frac{0.523}{44{,}000 \times 1} = 1.19 \times 10^{-5} \text{ mol/L}$

Det svarer til 11,9 mikromolar (μM). Det ligger inden for det område, hvor instrumenter måler mest nøjagtigt, så forskeren kan stole på tallet uden at fortynde prøven yderligere.

Fortolkning af absorbansværdier

• A = 0: intet lys absorberes ved denne bølgelængde.
• A = 0,3 til 0,9: det område, hvor de fleste spektrofotometre giver de mest nøjagtige og lineære målinger.
• A = 1,0: 90 % af lyset absorberes, og 10 % transmitteres.
• A = 2,0: 99 % absorberes, og 1 % transmitteres.
• A over 2,5: uden for det pålidelige område for de fleste instrumenter. Prøven bør fortyndes og måles igen.

Målinger under cirka 0,3 påvirkes af instrumentstøj. Målinger over cirka 1,5 påvirkes af små mængder strølys inde i instrumentet, hvilket giver fejl. Fortynding af prøven og en ny måling er den almindelige løsning, når en måling ligger uden for det nøjagtige område.

Hvor Beer-Lamberts lov anvendes

Analytisk kemi. Laboratorier måler absorbansen af en prøve og bruger formlen til at beregne en ukendt koncentration baglæns. Det er almindeligt ved analyse af nitrat-, fosfat- og metalionniveauer i vand samt ved kontrol af koncentrationen af et kemisk parti under produktionen.

Biokemi. Absorbans ved 280 nm bruges til at estimere proteinkoncentrationen. Absorbans ved 260 nm bruges til at estimere koncentrationen af DNA eller RNA; efter konvention svarer en absorbans på 1,0 til cirka 50 μg/mL dobbeltstrenget DNA eller 40 μg/mL RNA. Forholdet mellem de to målinger (A260/A280) giver et groft mål for prøvens renhed.

Lægemidler. Lægemiddelproducenter bruger absorbansmålinger til at undersøge, hvor hurtigt en tablet frigiver sit aktive stof, og til at følge, hvordan et lægemiddel nedbrydes under opbevaring over tid.

Medicin. Mange automatiserede blodanalyseinstrumenter måler absorbans fra kemiske reaktioner, der ændrer farve, for at bestemme niveauerne af glukose, leverenzymer og bilirubin.

Mad og drikke. Øllets farve måles ved absorbans ved 430 nm efter metoden fra European Brewery Convention (EBC). Lignende metoder bruges til at kontrollere farven på vin og læskedrikke.

Begrænsninger ved Beer-Lamberts lov

Loven forudsætter, at lyset har én præcis bølgelængde, og at prøven ikke spreder lys. Den fungerer ikke i nogle almindelige situationer:

• Høj koncentration. Over cirka 0,01 mol/L begynder opløste molekyler at påvirke hinanden, og absorbansen holder op med at stige lineært med koncentrationen.
• Uklare prøver eller prøver med partikler. Suspensioner og uklare væsker spreder lys ud over at absorbere det, hvilket forhøjer den målte absorbans. Beer-Lamberts lov tager ikke højde for lysspredning; en relateret model kaldet Kubelka-Munk-teorien bruges til uigennemsigtige eller lysspredende prøver såsom pulvere.
• Kemiske ændringer under målingen. Nogle stoffer nedbrydes under belysning eller ændrer sig med pH-værdien under målingen, hvilket ændrer måleresultatet undervejs.
• Temperaturændringer. Den molare absorptionskoefficient afhænger af temperaturen, så målinger foretaget ved forskellige temperaturer kan ikke sammenlignes direkte.

Historie

Loven udviklede sig over mere end et århundrede gennem tre videnskabsmænds arbejde. Pierre Bouguer beskrev i 1729, hvordan hvert lige tykt lag af et materiale absorberer en lige stor andel af det lys, der passerer gennem det. Johann Heinrich Lambert formulerede denne sammenhæng matematisk i sin bog Photometria fra 1760 og viste, at absorbansen stiger i direkte forhold til vejlængden. August Beer udvidede i 1852 loven og viste, at absorbansen også stiger i direkte forhold til koncentrationen. Den samlede lov kaldes nogle gange Bouguer-Beer-Lamberts lov som anerkendelse af alle tre.

Ofte stillede spørgsmål

Hvad bruges Beer-Lamberts lov til? Den beregner, hvor meget lys en opløsning absorberer, og kan bruges omvendt til at finde en ukendt koncentration ud fra en målt absorbans. Derfor danner den grundlag for UV-Vis-spektrofotometri, en almindelig laboratorieteknik til at måle mængden af et stof i en opløsning.

Hvilke enheder bruger Beer-Lamberts lov? Den optiske vejlængde angives i centimeter, den molare absorptionskoefficient i L/(mol·cm), og koncentrationen i mol/L. Absorbansen har ingen enhed, selv om den undertiden betegnes "AU" for absorbansenheder. Hvis andre enheder indsættes i formlen uden først at blive omregnet, bliver resultatet forkert.

Hvorfor er min absorbansmåling ikke proportional med koncentrationen? De mest almindelige årsager er en koncentration over cirka 0,01 mol/L, en uklar prøve eller en prøve med partikler eller en måling langt uden for området 0,3–0,9, hvor instrumenterne er mest nøjagtige. Fortynding af prøven og en ny måling viser normalt, hvilken årsag der er relevant.

Hvad er forskellen mellem absorbans og transmission? Transmission er den brøkdel af lyset, der passerer gennem en prøve. Absorbansen er den negative logaritme med grundtal 10 af transmissionen: A = −log₁₀(T). Når absorbansen stiger, falder transmissionen.

Hvad er forskellen mellem absorbans og optisk densitet? Det er den samme størrelse. "Optisk densitet" er den betegnelse, der oftere bruges i biologi, mens "absorbans" er mere almindelig i kemi.

Hvilket absorbansområde er mest nøjagtigt? Cirka 0,3 til 0,9. Under dette område dominerer instrumentstøj signalet. Over cirka 1,5 giver strølys inde i instrumentet fejl, og over cirka 2,5 kan de fleste instrumenter slet ikke give en pålidelig måling.

Referencer

1. Technische Universität Braunschweig, Institut for Fysisk og Teoretisk Kemi. Beer-Lambert Law. TU Braunschweig, Beer-Lamberts lov — A = ε × b × c med ε i M⁻¹ cm⁻¹; A = −log(T); ikke-linearitet ved høje koncentrationer (>0,01 M), spredning og strølys.
2. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., & Popp, J. The Bouguer-Beer-Lambert Law: Shining Light on the Obscure. ChemPhysChem 21(18), 2020, åben adgang via PubMed Central. Mayerhöfer m.fl. 2020 (PMC) — navnet Bouguer-Beer-Lambert samt Bouguers, Lamberts og Beers roller (Beer, Ann. Phys., 1852).