Enzymaktivitätsrechner - Michaelis-Menten-Kinetik

Rechner für Enzymaktivität

Ein Rechner für Enzymaktivität ermittelt, wie schnell ein Enzym ein Substrat in ein Produkt umwandelt, ausgedrückt als spezifische Aktivität in Einheiten pro Milligramm (U/mg). Dazu verwendet er die Michaelis-Menten-Gleichung, das Standardmodell der Enzymkinetik, zusammen mit der Menge an Enzymprotein in der Probe.

Enzyme sind Proteine, die chemische Reaktionen in Zellen beschleunigen, ohne dabei verbraucht zu werden. Wissenschaftler messen, wie aktiv ein Enzym ist, um verschiedene Chargen zu vergleichen, zu prüfen, ob ein Reinigungsschritt erfolgreich war, oder zu testen, wie ein Wirkstoff die Geschwindigkeit eines Enzyms beeinflusst. Die Enzymkonzentration allein sagt nicht aus, ob das Enzym seine Aufgabe erfüllt. Das zeigt die spezifische Aktivität.

Was der Rechner berechnet

Das Werkzeug benötigt fünf Eingaben: Enzymkonzentration, Substratkonzentration, die Michaelis-Konstante (Km), die Maximalgeschwindigkeit (Vmax) und die Reaktionszeit. Die Reaktionszeit wird zu Referenzzwecken erfasst, geht aber nicht in die Formel ein. Vmax ist bereits eine Rate, also eine pro Minute umgesetzte Substratmenge; die Zeit ist darin enthalten. Eine erneute Division durch die Zeit würde sie doppelt berücksichtigen.

Der Rechner gibt eine Zahl und ein Diagramm aus:

• Spezifische Aktivität, in U/mg. Dies ist die Reaktionsgeschwindigkeit geteilt durch die vorhandene Menge an Enzymprotein.
• Ein Diagramm der Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Substratkonzentration, das den niedrigen, den Übergangs- und den gesättigten Bereich der Kurve zeigt. Die Geschwindigkeit bei der eingegebenen Substratkonzentration ist darin markiert.

So wird die Enzymaktivität berechnet

Die Michaelis-Menten-Gleichung

Leonor Michaelis und Maud Menten veröffentlichten dieses Modell im Jahr 1913. Es beschreibt, wie die Reaktionsgeschwindigkeit eines Enzyms von der Substratkonzentration abhängt:

$v = \frac{V_{max} \times [S]}{K_m + [S]}$

• $v$ = Reaktionsgeschwindigkeit, die Rate bei einer bestimmten Substratkonzentration
• $V_{max}$ = Maximalgeschwindigkeit, die Rate bei vollständiger Sättigung des Enzyms mit Substrat
• $[S]$ = Substratkonzentration
• $K_m$ = Michaelis-Konstante: die Substratkonzentration, bei der die Geschwindigkeit halb so groß wie Vmax ist

Formel für die spezifische Aktivität

Die spezifische Aktivität ergibt sich aus der Division dieser Geschwindigkeit durch die vorhandene Menge an Enzymprotein; das Ergebnis wird in Einheiten pro Milligramm (U/mg) angegeben:

$A = \frac{v}{[E]} = \frac{V_{max} \times [S]}{(K_m + [S]) \times [E]}$

Hier ist $A$ die spezifische Aktivität und $[E]$ die Enzymkonzentration.

Eine Enzymeinheit (U) ist die Enzymmenge, die pro Minute 1 Mikromol (µmol) Substrat umsetzt. Diese Definition wurde von der International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) festgelegt.

Die Einheiten ergeben sich wie folgt. In der Michaelis-Menten-Gleichung hat die Geschwindigkeit die Einheit Substratkonzentration geteilt durch Zeit. Der Rechner verwendet [S] und Km in mM, daher werden Vmax und v in µmol pro Minute pro Milliliter angegeben, geschrieben als µmol/(min·mL). Das ist dasselbe wie mM/min und auch dasselbe wie U/mL. Die Enzymkonzentration [E] wird in mg/mL angegeben. Beim Dividieren kürzen sich die Milliliter heraus:

$\frac{\text{µmol}/(\text{min}\cdot\text{mL})}{\text{mg}/\text{mL}} = \frac{\text{µmol}}{\text{min}\cdot\text{mg}} = \text{U/mg}$

Vmax enthält bereits die Angabe „pro Minute“, daher gehört kein zusätzlicher Zeitfaktor in die Formel.

Diese Berechnung setzt voraus, dass die gemessene Geschwindigkeit eine Anfangsgeschwindigkeit ist, die früh in der Reaktion erfasst wird, bevor das Substrat knapp wird oder das Produkt beginnt, das Enzym zu hemmen. In Laboren werden üblicherweise die ersten 5–10% der Substratumsetzung gemessen, um in diesem linearen Bereich zu bleiben.

Rechenbeispiel

Beispiel 1. Enzymkonzentration 1 mg/mL, Substratkonzentration 10 mM, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/(min·mL). Mit diesen Werten startet der Rechner.

Geschwindigkeit = (50 × 10) / (5 + 10) = 500 / 15 = 33,33 µmol/(min·mL) Spezifische Aktivität = 33,33 / 1 = 33,33 U/mg

Beispiel 2. Gleiche Bedingungen, aber die Enzymkonzentration wurde auf 2 mg/mL verdoppelt.

Geschwindigkeit = 33,33 µmol/(min·mL), unverändert, da die Geschwindigkeit in dieser Gleichung nicht von [E] abhängt. Spezifische Aktivität = 33,33 / 2 = 16,67 U/mg

Eine Verdopplung der Enzymmenge halbiert die spezifische Aktivität, weil dieselbe Gesamtgeschwindigkeit nun auf die doppelte Proteinmenge verteilt wird.

Beispiel 3. Das Substrat wurde auf 100 mM erhöht und liegt damit deutlich über Km; die Enzymkonzentration beträgt 1 mg/mL, Km 5 mM und Vmax 50 µmol/(min·mL).

Geschwindigkeit = (50 × 100) / (5 + 100) = 5000 / 105 = 47,62 µmol/(min·mL) Spezifische Aktivität = 47,62 / 1 = 47,62 U/mg

Bei hoher Substratkonzentration ist das Enzym nahezu gesättigt, daher liegt die Geschwindigkeit nahe bei Vmax.

Beispiel 4. Das Substrat wurde auf 1 mM gesenkt und liegt damit unter Km; die Enzymkonzentration beträgt 1 mg/mL, Km 5 mM und Vmax 50 µmol/(min·mL).

Geschwindigkeit = (50 × 1) / (5 + 1) = 50 / 6 = 8,33 µmol/(min·mL) Spezifische Aktivität = 8,33 / 1 = 8,33 U/mg

Unterhalb von Km begrenzen geringe Substratmengen die Reaktion, daher bleiben sowohl die Geschwindigkeit als auch die spezifische Aktivität deutlich hinter Vmax zurück.

Die wichtigsten Parameter erklärt

Die Enzymkonzentration [E] ist die Masse des Enzymproteins pro Volumen, angegeben in mg/mL. Ein höherer Wert verteilt dieselbe Reaktionsgeschwindigkeit auf mehr Protein und senkt dadurch die spezifische Aktivität. Die spezifische Aktivität, nicht die reine Konzentration, zeigt, ob eine Enzympräparation gut funktioniert.

Die Substratkonzentration [S] gibt an, wie viel Substrat dem Enzym zur Verfügung steht, üblicherweise in mM. Bei niedriger [S] erhöhen kleine Zunahmen die Geschwindigkeit deutlich. Nahe der Sättigung bringt zusätzliches Substrat kaum noch einen Vorteil.

Michaelis-Konstante (Km) ist die Substratkonzentration, bei der die Geschwindigkeit der Hälfte von Vmax entspricht. Ein niedriger Km bedeutet, dass das Enzym bereits bei einer niedrigen Substratkonzentration die halbe Geschwindigkeit erreicht; dies weist auf eine starke Bindung zwischen Enzym und Substrat hin. Hexokinase hat beispielsweise für Glucose einen Km-Wert von etwa 0,1 mM, was eine hohe Affinität zeigt.

Die Maximalgeschwindigkeit (Vmax) ist die Rate, wenn das Substrat nicht mehr limitierend ist. Geben Sie sie in µmol/(min·mL) an, also ebenso wie mM/min oder U/mL, damit sie zu den für [S] und Km verwendeten mM passt. Sie hängt davon ab, wie viel Enzym vorhanden ist und wie schnell jedes Enzymmolekül Substrat umsetzen kann (seine Umsatzzahl, kcat).

Reaktionszeit ist die Dauer, während der der Assay durchgeführt wurde. Sie hilft bei der Planung eines Experiments, da eine zu lange laufende Reaktion das Substrat aufbrauchen kann und sich dann nicht mehr linear verhält. Sie ist selbst kein Bestandteil der Formel für die spezifische Aktivität.

Die Geschwindigkeitskurve ablesen

Das Diagramm stellt die Geschwindigkeit in Abhängigkeit von der Substratkonzentration mithilfe der Michaelis-Menten-Gleichung dar.

• Unterhalb von Km: Die Geschwindigkeit steigt ungefähr proportional zum Substrat. Kleine Fehler bei der Substratkonzentration verursachen große Fehler im Ergebnis.
• Nahe Km: Die Kurve krümmt sich. Die Geschwindigkeit beträgt die Hälfte von Vmax.
• Oberhalb von Km: Die Kurve flacht ab. Zusätzliches Substrat erhöht die Geschwindigkeit nur geringfügig, weil das Enzym nahezu gesättigt ist.

Warum die spezifische Aktivität wichtig ist

Die spezifische Aktivität ist ein Standardmaß für die Reinheit und Qualität eines Enzyms. Während der Reinigung verfolgen Wissenschaftler sie bei jedem Schritt: Ein roher Zellextrakt kann einige U/mg aufweisen, während eine hochgereinigte Probe Hunderte oder Tausende U/mg erreichen kann. Eine steigende spezifische Aktivität im Verlauf der Reinigung zeigt, dass inaktives Protein entfernt wird, während das gewünschte Enzym erhalten bleibt.

Dieselbe Messung unterstützt die Wirkstoffentwicklung, bei der Forscher prüfen, wie Kandidatenverbindungen die Aktivität eines Enzyms senken, sowie die klinische Diagnostik, bei der Ärzte Enzyme wie ALT und AST im Blut messen, um Leberschäden festzustellen.

Häufig gestellte Fragen

Wie berechnet man die Enzymaktivität aus Km und Vmax? Bestimmen Sie zunächst die Reaktionsgeschwindigkeit mit der Michaelis-Menten-Gleichung, v = (Vmax × [S]) / (Km + [S]). Teilen Sie sie anschließend durch die Enzymkonzentration, um die spezifische Aktivität in U/mg zu erhalten: Aktivität = v / [E]. Verwenden Sie Vmax in µmol/(min·mL) und [E] in mg/mL, damit sich die Einheiten zu U/mg kürzen.

Was ist eine Einheit (U) der Enzymaktivität? Eine Einheit ist die Enzymmenge, die unter den angegebenen Bedingungen 1 µmol Substrat pro Minute umsetzt, wie von der IUBMB definiert.

Warum enthält die Formel keine Reaktionszeit? Vmax wird bereits als Menge pro Minute angegeben und ist daher eine Rate, keine Gesamtmenge. Eine erneute Division durch die Zeit würde diese bereits berücksichtigte Zeit doppelt erfassen und dazu führen, dass das Ergebnis davon abhängt, wie lange der Test lief. Das sollte bei einer Eigenschaft des Enzyms selbst nicht der Fall sein.

Warum sinkt die spezifische Aktivität, wenn die Enzymkonzentration steigt? Die Geschwindigkeit in der Michaelis-Menten-Gleichung hängt nicht von der Enzymkonzentration ab. Bei der spezifischen Aktivität wird diese feste Geschwindigkeit durch [E] geteilt, sodass ein größerer Wert von [E] ein kleineres Ergebnis ergibt. Enzympräparationen mit unterschiedlichen Konzentrationen werden fair verglichen, indem man die spezifische Aktivität und nicht die reine Geschwindigkeit vergleicht.

Was bedeutet ein niedriger Km-Wert? Ein niedriger Km-Wert bedeutet, dass das Enzym bei einer niedrigen Substratkonzentration die Hälfte seiner Maximalgeschwindigkeit erreicht. Das deutet darauf hin, dass Enzym und Substrat fest aneinander binden.

Kann die spezifische Aktivität negativ sein? Nein. Ein negatives Ergebnis weist auf einen Eingabefehler, etwa eine negative Konzentration, oder auf einen Rechenfehler hin, nicht auf eine tatsächliche Enzymmessung.

Referenzen

1. Michaelis, L., & Menten, M. L. (1913). Die Kinetik der Invertinwirkung. Biochemische Zeitschrift, 49, 333-369.
2. Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Stryer, L. (2012). Biochemistry (7. Auflage). W.H. Freeman and Company.
3. International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB). Enzyme Nomenclature. https://iubmb.qmul.ac.uk/
4. BRENDA Enzyme Database. https://www.brenda-enzymes.org/