Enzymaktivitätsrechner - Michaelis-Menten-Kinetik

Rechner für Enzymaktivität

Ein Rechner für Enzymaktivität ermittelt, wie schnell ein Enzym ein Substrat in ein Produkt umwandelt, ausgedrückt als spezifische Aktivität in Einheiten pro Milligramm (U/mg). Dazu verwendet er die Michaelis-Menten-Gleichung, das Standardmodell der Enzymkinetik, zusammen mit der Menge an Enzymprotein in der Probe.

Enzyme sind Proteine, die chemische Reaktionen in Zellen beschleunigen, ohne dabei verbraucht zu werden. Wissenschaftler messen, wie aktiv ein Enzym ist, um verschiedene Chargen zu vergleichen, zu prüfen, ob ein Reinigungsschritt erfolgreich war, oder zu testen, wie ein Wirkstoff die Geschwindigkeit eines Enzyms beeinflusst. Die Enzymkonzentration allein sagt nicht aus, ob das Enzym seine Aufgabe erfüllt. Das zeigt die spezifische Aktivität.

Was der Rechner berechnet

Das Werkzeug benötigt fünf Eingaben: Enzymkonzentration, Substratkonzentration, die Michaelis-Konstante (Km), die Maximalgeschwindigkeit (Vmax) und die Reaktionszeit. Die Reaktionszeit wird zur Orientierung erfasst, geht aber nicht in die Formel ein, denn Vmax ist bereits eine Rate: eine pro Minute umgesetzte Substratmenge. Die Zeit ist darin schon enthalten. Würde man erneut durch die Zeit teilen, würde sie doppelt gezählt.

Der Rechner gibt Folgendes zurück:

• Spezifische Aktivität in U/mg, auf vier Dezimalstellen angezeigt: die Reaktionsgeschwindigkeit geteilt durch die vorhandene Menge an Enzymprotein
• Ein Diagramm der Reaktionsgeschwindigkeit gegen die Substratkonzentration, von null bis zum Dreifachen der eingegebenen Substratkonzentration, wobei der eingegebene Wert als Punkt markiert ist

So wird die Enzymaktivität berechnet

Die Michaelis-Menten-Gleichung

Leonor Michaelis und Maud Menten veröffentlichten dieses Modell im Jahr 1913. Es beschreibt, wie die Reaktionsgeschwindigkeit eines Enzyms von der Substratkonzentration abhängt:

$v = \frac{V_{max} \times [S]}{K_m + [S]}$

• $v$ = Reaktionsgeschwindigkeit, die Rate bei einer bestimmten Substratkonzentration
• $V_{max}$ = Maximalgeschwindigkeit, die Rate bei vollständiger Sättigung des Enzyms mit Substrat
• $[S]$ = Substratkonzentration
• $K_m$ = die Michaelis-Konstante: die Substratkonzentration, bei der die Geschwindigkeit die Hälfte von Vmax beträgt

Formel für die spezifische Aktivität

Die spezifische Aktivität ergibt sich aus der Division dieser Geschwindigkeit durch die vorhandene Menge an Enzymprotein; das Ergebnis wird in Einheiten pro Milligramm (U/mg) angegeben:

$\text{Spezifische Aktivität} = \frac{v}{[E]} = \frac{V_{max} \times [S]}{(K_m + [S]) \times [E]}$

$[E]$ ist die Enzymkonzentration in mg/mL. Eine Enzymeinheit (U) ist die Enzymmenge, die 1 Mikromol (µmol) Substrat pro Minute umsetzt. Diese Einheit ist in Biochemie und Medizin seit 1964 weit verbreitet. Da Vmax in µmol/min eingegeben wird, enthält es bereits dieses „pro Minute“. In der Formel kommt kein eigener Zeitterm vor.

Diese Berechnung setzt voraus, dass die gemessene Geschwindigkeit eine Anfangsgeschwindigkeit ist, also früh in der Reaktion gemessen wird, bevor das Substrat knapp wird oder das Produkt das Enzym zu hemmen beginnt. Michaelis und Menten selbst nutzten Messungen der Anfangsgeschwindigkeit, um den Einfluss der Reaktionsprodukte zu vermeiden.

Beispiele

Beispiel 1. Enzymkonzentration 1 mg/mL, Substratkonzentration 10 mM, Km 5 mM, Vmax 50 µmol/min.

Geschwindigkeit = (50 × 10) / (5 + 10) = 500 / 15 = 33,33 µmol/min Spezifische Aktivität = 33,33 / 1 = 33,33 U/mg (der Rechner zeigt 33,3333)

Dies sind die Standardwerte des Rechners.

Beispiel 2. Gleiche Bedingungen, aber die Enzymkonzentration wurde auf 2 mg/mL verdoppelt.

Geschwindigkeit = 33,33 µmol/min (unverändert, da die Geschwindigkeit in dieser Gleichung nicht von [E] abhängt) Spezifische Aktivität = 33,33 / 2 = 16,67 U/mg

Eine Verdopplung der Enzymmenge halbiert die spezifische Aktivität, weil dieselbe Gesamtgeschwindigkeit nun auf die doppelte Proteinmenge verteilt wird.

Beispiel 3. Substrat auf 100 mM erhöht, weit über Km, bei einer Enzymkonzentration von 1 mg/mL, Km 5 mM und Vmax 50 µmol/min.

Geschwindigkeit = (50 × 100) / (5 + 100) = 5000 / 105 = 47,62 µmol/min Spezifische Aktivität = 47,62 / 1 = 47,62 U/mg

Bei hoher Substratkonzentration ist das Enzym nahezu gesättigt, daher liegt die Geschwindigkeit nahe bei Vmax.

Beispiel 4. Substrat auf 1 mM gesenkt, unter Km, bei einer Enzymkonzentration von 1 mg/mL, Km 5 mM und Vmax 50 µmol/min.

Geschwindigkeit = (50 × 1) / (5 + 1) = 50 / 6 = 8,33 µmol/min Spezifische Aktivität = 8,33 / 1 = 8,33 U/mg

Unterhalb von Km begrenzen geringe Substratmengen die Reaktion, daher bleiben sowohl die Geschwindigkeit als auch die spezifische Aktivität deutlich hinter Vmax zurück.

Die wichtigsten Parameter erklärt

Die Enzymkonzentration [E] ist die Masse des Enzymproteins pro Volumen, angegeben in mg/mL. Ein höherer Wert verteilt dieselbe Reaktionsgeschwindigkeit auf mehr Protein und senkt dadurch die spezifische Aktivität. Die spezifische Aktivität, nicht die reine Konzentration, zeigt, ob eine Enzympräparation gut funktioniert.

Die Substratkonzentration [S] gibt an, wie viel Substrat dem Enzym zur Verfügung steht, üblicherweise in mM. Bei niedriger [S] erhöhen kleine Zunahmen die Geschwindigkeit deutlich. Nahe der Sättigung bringt zusätzliches Substrat kaum noch einen Vorteil.

Die Michaelis-Konstante (Km) ist die Substratkonzentration, bei der die Geschwindigkeit der Hälfte von Vmax entspricht. Ein niedriger Km-Wert bedeutet, dass das Enzym bei niedriger Substratkonzentration die halbe Geschwindigkeit erreicht, ein Zeichen für eine feste Bindung zwischen Enzym und Substrat.

Die Maximalgeschwindigkeit (Vmax) ist die Rate, wenn das Substrat nicht mehr limitierend ist. Sie hängt davon ab, wie viel Enzym vorhanden ist und wie schnell jedes Enzymmolekül Substrat umsetzen kann (seine Wechselzahl, kcat).

Die Reaktionszeit gibt an, wie lange der Assay lief. Sie ist nützlich für die Planung eines Experiments, weil eine zu lange laufende Reaktion das Substrat aufbrauchen und nicht mehr linear verlaufen kann. Sie ist selbst kein Teil der Formel für die spezifische Aktivität.

Die Geschwindigkeitskurve ablesen

Das Diagramm trägt die Geschwindigkeit mithilfe der Michaelis-Menten-Gleichung gegen die Substratkonzentration auf, von null bis zum Dreifachen der eingegebenen Substratkonzentration.

• Unterhalb von Km: Die Geschwindigkeit steigt ungefähr proportional zum Substrat. Kleine Fehler bei der Substratkonzentration verursachen große Fehler im Ergebnis.
• Nahe Km: Die Kurve krümmt sich. Die Geschwindigkeit beträgt die Hälfte von Vmax.
• Oberhalb von Km: Die Kurve flacht ab. Zusätzliches Substrat erhöht die Geschwindigkeit nur geringfügig, weil das Enzym nahezu gesättigt ist.

Warum die spezifische Aktivität wichtig ist

Die spezifische Aktivität ist ein gängiges Maß für Reinheit und Qualität eines Enzyms. Bei der Aufreinigung verfolgen Forschende sie in jedem Schritt. Ein roher Zellextrakt hat eine niedrige spezifische Aktivität, die mit der Aufreinigung des Enzyms ansteigt. Eine steigende spezifische Aktivität im Verlauf einer Aufreinigung zeigt, dass inaktives Protein entfernt wird, während das gesuchte Enzym erhalten bleibt.

Dieselbe Messung unterstützt die Wirkstoffentwicklung, bei der Forscher prüfen, wie Kandidatenverbindungen die Aktivität eines Enzyms senken, sowie die klinische Diagnostik, bei der Ärzte Enzyme wie ALT und AST im Blut messen, um Leberschäden festzustellen.

Häufig gestellte Fragen

Wie berechnet man die Enzymaktivität aus Km und Vmax? Bestimmen Sie zuerst die Reaktionsgeschwindigkeit mit der Michaelis-Menten-Gleichung, v = (Vmax × [S]) / (Km + [S]). Teilen Sie sie dann durch die Enzymkonzentration, um die spezifische Aktivität in U/mg zu erhalten: Aktivität = v / [E].

Was ist eine Einheit (U) der Enzymaktivität? Eine Einheit ist die Enzymmenge, die unter den angegebenen Bedingungen 1 µmol Substrat pro Minute umsetzt, wie von der IUBMB definiert.

Warum enthält die Formel keine Reaktionszeit? Vmax wird bereits als Menge pro Minute angegeben und ist daher eine Rate, keine Gesamtmenge. Eine erneute Division durch die Zeit würde diese bereits berücksichtigte Zeit doppelt erfassen und dazu führen, dass das Ergebnis davon abhängt, wie lange der Assay lief. Das sollte bei einer Eigenschaft des Enzyms selbst nicht der Fall sein.

Warum sinkt die spezifische Aktivität, wenn die Enzymkonzentration steigt? Die Geschwindigkeit in der Michaelis-Menten-Gleichung hängt nicht von der Enzymkonzentration ab. Bei der spezifischen Aktivität wird diese feste Geschwindigkeit durch [E] geteilt, sodass ein größerer Wert von [E] ein kleineres Ergebnis ergibt. Enzympräparationen mit unterschiedlichen Konzentrationen werden fair verglichen, indem man die spezifische Aktivität und nicht die reine Geschwindigkeit vergleicht.

Was bedeutet ein niedriger Km-Wert? Ein niedriger Km-Wert bedeutet, dass das Enzym bei einer niedrigen Substratkonzentration die Hälfte seiner Maximalgeschwindigkeit erreicht. Das deutet darauf hin, dass Enzym und Substrat fest aneinander binden.

Kann die spezifische Aktivität negativ sein? Nein. Der Rechner gibt 0 zurück, wenn die Enzymkonzentration null oder kleiner ist oder wenn Substratkonzentration, Km oder Vmax negativ ist. Ein negativer Wert würde auf einen Eingabefehler hinweisen, nicht auf eine echte Enzymmessung.

Referenzen

1. Johnson, K. A., & Goody, R. S. (2011). The Original Michaelis Constant: Translation of the 1913 Michaelis-Menten Paper. Biochemistry 50(39). PubMed Central, Volltext — die Veröffentlichung von 1913 und ihre Verwendung von Messungen der Anfangsgeschwindigkeit.
2. IUBMB. Symbolism and Terminology in Enzyme Kinetics, sections 4–6. Enzymreaktionen mit einem einzelnen Substrat — Die Michaelis-Konstante ist die Substratkonzentration, bei der v = 0,5 V.
3. BIPM. Resolution 12 of the 21st CGPM (1999). Besondere Bezeichnung für die abgeleitete SI-Einheit Mol pro Sekunde, das Katal — die Enzymeinheit U entspricht 1 µmol/min und wird seit 1964 verwendet.