Protein-Löslichkeitsrechner - Kostenfreies pH- & Temperatur-Tool

Ein Rechner für die Proteinlöslichkeit schätzt die höchste Konzentration eines Proteins, die unter einem bestimmten pH-Wert, einer bestimmten Temperatur und Ionenstärke in einem Lösungsmittel gelöst bleibt. Er wandelt grundlegende Chemie in eine einzige Zahl um: Milligramm Protein pro Milliliter Lösungsmittel.

Die Proteinlöslichkeit ist in der Biochemie, der Arzneimittelformulierung und der Lebensmittelwissenschaft von Bedeutung. Ein Protein, das in Lösung nicht stabil bleibt, kann Aggregate oder Niederschläge bilden, die ein Experiment unbrauchbar machen oder die Injektion eines Arzneimittels unmöglich machen können.

So wird die Proteinlöslichkeit berechnet

Die Löslichkeit hängt von fünf Faktoren ab: dem isoelektrischen Punkt des Proteins (dem pH-Wert, bei dem seine Nettoladung null ist), seinem Schmelzpunkt (der Temperatur, bei der es beginnt, sich zu entfalten), der Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittels (einem Maß dafür, wie gut es geladene Teilchen voneinander trennt), dem pH-Wert der Lösung und der Ionenstärke (einem Maß dafür, wie viel gelöstes Salz vorhanden ist).

Der Rechner geht von der bekannten Löslichkeit jedes Proteins in Wasser unter festgelegten Referenzbedingungen aus: 25 °C, pH 7,0 und einer Ionenstärke von 0,15 M (etwa dem Salzgehalt des Blutes). Anschließend multipliziert er diesen Referenzwert mit vier Verhältnissen, je einem für jede geänderte Bedingung.

Formel für die Proteinlöslichkeit

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ ist die bekannte Löslichkeit des Proteins in Wasser unter den Referenzbedingungen, angegeben in mg/ml.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, wobei $pI$ der isoelektrische Punkt des Proteins ist. Am isoelektrischen Punkt ist die Löslichkeit am niedrigsten und steigt, wenn sich der pH-Wert davon entfernt; innerhalb von ein bis zwei pH-Einheiten flacht der Anstieg ab.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, wobei $I$ die Ionenstärke in Mol pro Liter ist. Bei niedriger Salzkonzentration erhöht dieser Term die Löslichkeit geringfügig („Einsalzen“). Bei hoher Salzkonzentration senkt er die Löslichkeit („Aussalzen“).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, wobei $T_m$ der Schmelzpunkt des Proteins in °C ist. Die Löslichkeit steigt mit der Temperatur zunächst langsam an und fällt dann stark ab, sobald sich die Temperatur $T_m$ nähert und das Protein beginnt, sich zu entfalten.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, wobei $\varepsilon$ die Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittels ist. Wasser hat eine Dielektrizitätskonstante von 78,4, daher ist dieser Term in Wasser gleich 1. Lösungsmittel, die Ladungen weniger wirksam als Wasser trennen, etwa Ethanol, senken die Löslichkeit.

Vom Rechner verwendete Referenzwerte

Löslichkeitskategorien

Beispiel: Albumin in Phosphatpuffer

Bestimmen Sie die Löslichkeit von Albumin in Phosphatpuffer bei 25 °C, pH 7,4 und einer Ionenstärke von 0,15 M.

Die Referenzwerte für Albumin sind $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/ml und $T_m = 63°C$. Phosphatpuffer hat eine Dielektrizitätskonstante von 76,0.

1. pH-Term: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Verhältnis: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Ionenterm: Die Ionenstärke (0,15 M) entspricht dem Referenzwert, daher beträgt das Verhältnis 1.
3. Temperaturterm: Die Temperatur (25 °C) entspricht dem Referenzwert, daher beträgt das Verhältnis 1.
4. Lösungsmittelterm: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/mL}$

Der Rechner gibt 492,12 mg/ml aus, was in die Kategorie „sehr gut löslich“ fällt.

Beispiel: Lysozym in Glycerin bei niedriger Temperatur

Bestimmen Sie die Löslichkeit von Lysozym in einer Glycerinlösung bei 4 °C, pH 5,0 und einer Ionenstärke von 0,1 M. Diese Bedingungen ähneln der Kühllagerung eines Enzyms.

Die Referenzwerte für Lysozym sind $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/mL und $T_m = 72°C$. Glycerin hat eine Dielektrizitätskonstante von 42,5.

1. pH-Term: Die Änderung von pH 7,0 zu pH 5,0 (beide deutlich unter dem pI von 11,35) verändert den pH-Term nur geringfügig. Verhältnis: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Ionenterm: Die Verringerung der Ionenstärke von 0,15 M auf 0,1 M erhöht die Löslichkeit geringfügig durch den Einsalzeffekt. Verhältnis: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Temperaturterm: Das Abkühlen von 25 °C auf 4 °C, deutlich unter den Schmelzpunkt, senkt den Term. Verhältnis: 0,8106.
4. Lösungsmittelterm: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/mL}$

Der Rechner gibt 35,88 mg/mL aus, was in die Kategorie „löslich“ fällt. Die niedrige Dielektrizitätskonstante von Glycerin, nicht die kalte Temperatur, senkt das Ergebnis gegenüber dem Referenzwert.

So wird der Rechner für die Proteinlöslichkeit verwendet

1. Wählen Sie ein Protein aus der Liste: Albumin, Insulin, Lysozym, Hämoglobin, Myoglobin, Kollagen, Kasein oder Fibrinogen.
2. Wählen Sie ein Lösungsmittel: Wasser, Phosphatpuffer, Tris-Puffer, Glycerin, DMSO, Methanol, Ethanol oder Aceton.
3. Geben Sie die Temperatur in °C (0 bis 100), den pH-Wert (0 bis 14) und die Ionenstärke in molarer Konzentration (0 bis 2) ein.
4. Lesen Sie die berechnete Löslichkeit in mg/ml und ihre Kategorie ab. Ein Balken unter dem Ergebnis zeigt den Wert auf einer Skala von 0 bis 100 mg/ml an und ist bei 100 mg/ml oder mehr vollständig gefüllt.

Was beeinflusst die Proteinlöslichkeit?

pH-Wert und isoelektrischer Punkt. Jedes Protein hat einen isoelektrischen Punkt, den pH-Wert, bei dem seine Oberfläche keine elektrische Nettoladung trägt. Bei diesem pH-Wert stoßen sich die Proteinmoleküle nicht ab, sodass sie leichter verklumpen und aus der Lösung ausfallen. Wird der pH-Wert in die eine oder andere Richtung vom isoelektrischen Punkt wegbewegt, erhält das Protein eine Nettoladung. Geladene Moleküle stoßen sich gegenseitig ab, wodurch sie getrennt und gelöst bleiben.

Ionenstärke. Gelöste Salzionen umgeben die geladenen Oberflächengruppen eines Proteins. Bei niedrigen bis mittleren Konzentrationen schirmen diese Ionen Ladungen ab, die andernfalls zwei Proteinmoleküle aneinanderziehen würden, und erhöhen dadurch die Löslichkeit. Dies wird als Einsalzen bezeichnet. Bei hohen Salzkonzentrationen konkurrieren die Ionen mit dem Protein um Wassermoleküle und entfernen die Wasserschicht, die das Protein gelöst hält. Dies wird als Aussalzen bezeichnet und bildet die Grundlage eines gängigen Aufreinigungsverfahrens, bei dem Proteine mit Ammoniumsulfat aus einem Gemisch ausgefällt werden.

Temperatur. Das Erwärmen einer Lösung erhöht im Allgemeinen bis zu einem bestimmten Punkt die Löslichkeit. Sobald sich die Temperatur dem Schmelzpunkt eines Proteins nähert, beginnt sich das Protein zu entfalten. Durch die Entfaltung werden hydrophobe (Wasser abweisende) Bereiche des Proteins freigelegt, die normalerweise im Inneren seiner gefalteten Struktur verborgen sind. Diese freigelegten Bereiche haften aneinander und verursachen Aggregation, sodass die Löslichkeit in der Nähe und oberhalb des Schmelzpunkts stark abnimmt.

Lösungsmittel. Die Dielektrizitätskonstante eines Lösungsmittels gibt an, wie wirksam es die elektrische Anziehung zwischen geladenen Teilchen abschwächt. Wasser hat eine hohe Dielektrizitätskonstante und trennt Ladungen gut. Deshalb lösen sich die meisten Proteine in Wasser besser als in organischen Lösungsmitteln wie Ethanol oder Aceton. Lösungsmittel mit niedriger Dielektrizitätskonstante ermöglichen es entgegengesetzten Ladungen auf verschiedenen Proteinmolekülen, sich stärker anzuziehen, und begünstigen dadurch die Aggregation.

Einschränkungen

Der Rechner verwendet ein vereinfachtes Modell, das auf einer kleinen Gruppe von Referenzproteinen und Standardlösungsmitteln beruht. Er berücksichtigt weder die Reinheit des Proteins noch Zusatzstoffe wie Detergenzien oder Stabilisatoren oder ungewöhnliche Pufferbestandteile. Die Ergebnisse sind Schätzungen zur Planung von Experimenten und kein Ersatz für eine direkte Messung der Löslichkeit im Labor.

Häufig gestellte Fragen

Was ist Proteinlöslichkeit? Die Proteinlöslichkeit ist die maximale Konzentration eines Proteins, die in einem Lösungsmittel vollständig gelöst bleibt, ohne sichtbare Aggregate oder Präzipitate zu bilden.

Warum ist ein Protein an seinem isoelektrischen Punkt am wenigsten löslich? Am isoelektrischen Punkt trägt das Protein keine elektrische Nettoladung, sodass sich die Proteinmoleküle nicht mehr elektrisch abstoßen. Ohne diese Abstoßung haften sie leichter aneinander und fallen aus der Lösung aus.

Was ist der Unterschied zwischen Einsalzen und Aussalzen? Einsalzen tritt bei niedrigen Salzkonzentrationen auf. Dabei schirmen gelöste Ionen die geladenen Gruppen des Proteins voneinander ab und erhöhen die Löslichkeit. Aussalzen tritt bei hohen Salzkonzentrationen auf. Dabei entziehen die Ionen der Proteinoberfläche Wasser und verringern die Löslichkeit.

Erhöht eine höhere Temperatur immer die Löslichkeit? Nein. Die Löslichkeit steigt mit der Temperatur meist nur bis zu einem bestimmten Punkt. Sobald sich die Temperatur dem Schmelzpunkt eines Proteins nähert, beginnt sich das Protein zu entfalten, was normalerweise Aggregation und einen starken Rückgang der Löslichkeit verursacht.

Warum lösen sich Proteine in Ethanol oder Aceton schlechter als in Wasser? Wasser hat eine hohe Dielektrizitätskonstante und schwächt dadurch die elektrische Anziehung zwischen geladenen Bereichen von Proteinmolekülen sehr wirksam ab. Ethanol und Aceton haben niedrigere Dielektrizitätskonstanten, sodass sich geladene Gruppen verschiedener Proteinmoleküle in diesen Lösungsmitteln stärker anziehen und eine Aggregation wahrscheinlicher wird.

Wie genau ist dieser Rechner? Er liefert eine Schätzung auf Grundlage eines physikalischen Modells und einer kleinen Gruppe von Referenzproteinen und Lösungsmitteln. Er ist hilfreich, um die zu prüfenden Bedingungen einzugrenzen; zur Bestätigung der Löslichkeit einer bestimmten Proteinprobe bleibt jedoch eine experimentelle Messung erforderlich.

Weiterführende Literatur

• Arakawa, T., & Timasheff, S. N. (1984). Mechanismus des Einsalzens und Aussalzens von Proteinen durch Salze zweiwertiger Kationen. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., & Pace, C. N. (2008). Messung und Erhöhung der Proteinlöslichkeit. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J., & Edsall, J. T. (1943). Proteine, Aminosäuren und Peptide als Ionen und Zwitterionen. Reinhold Publishing.