מחשבון משקל מולקולרי של חלבון | כלי MW חינמי

מחשבון מסה מולקולרית של חלבון

מחשבון מסה מולקולרית של חלבון מוצא את מסת החלבון מרצף חומצות האמינו שלו. התוצאה ניתנת בדלטונים (Da), יחידת המידה המקובלת למסה מולקולרית. דלטון אחד קרוב למסה של אטום מימן יחיד.

למסה מולקולרית יש חשיבות בעבודת מעבדה שגרתית. היא מסייעת לחוקר לבחור אחוזי ג׳ל ל-SDS-PAGE, לבחור עמודה לסינון בג׳ל ולבדוק אם תוצאה של ספקטרומטריית מסות תואמת לחלבון הצפוי. הערך שהמחשבון נותן הוא מסה תאורטית המבוססת על הרצף בלבד. חלבונים אמיתיים עשויים לשקול יותר בגלל תוספות כימיות שנוצרות לאחר בניית החלבון, הנקראות שינויים לאחר התרגום. אלה נעות מכמה דלטונים עבור קבוצת פוספט יחידה ועד עשרות אלפי דלטונים עבור שרשראות סוכר גדולות.

כיצד לחשב מסה מולקולרית של חלבון

הנוסחה

$MW_{protein} = \sum_{i=1}^{n} MW_{residue_i} + MW_{water}$

כל חומצת אמינו בשרשרת תורמת את מסת השייר שלה, ולא את מסת חומצת האמינו החופשית. כאשר שתי חומצות אמינו מתחברות בקשר פפטידי, התגובה משחררת מולקולת מים אחת. מסות השיירים כבר מחושבות לאחר הסרת המים האלה, ולכן סכימת הרצף מביאה בחשבון באופן אוטומטי את כל הקשרים הפפטידיים הפנימיים.

לאחר סכימת השיירים, מוסיפים בחזרה מולקולת מים אחת (18.010565 Da). כך מובאים בחשבון שני הקצוות החופשיים של השרשרת: אטום מימן בתחילתה (הקצה ה-N-טרמינלי) וקבוצת הידרוקסיל בסופה (הקצה ה-C-טרמינלי).

טעות נפוצה היא להפחית מים עבור כל קשר פפטידי ולאחר מכן להוסיף בנפרד מולקולת מים. כך סופרים פעמיים את אובדן המים, מכיוון שמסות השיירים שלהלן כבר אינן כוללות אותו. האיבר היחיד של מים בחישוב הוא המולקולה האחת שמוסיפים בסוף.

מסות שיירים של חומצות אמינו

אלה הן מסות השיירים המונואיזוטופיות, בדלטונים, של 20 חומצות האמינו הסטנדרטיות:

דוגמה פתורה

ניקח את השרשרת הקצרה אלנין-גליצין-סרין, הנכתבת AGS.

1. חברו את מסות השיירים: 71.03711 + 57.02146 + 87.03203 = 215.0906 Da.
2. הוסיפו מולקולת מים אחת עבור שני קצות השרשרת: 215.0906 + 18.010565 = 233.101165 Da.
3. לאחר עיגול לשתי ספרות אחרי הנקודה, המסה המולקולרית של AGS היא 233.10 Da.

אין להפחית מים נוספים עבור שני הקשרים הפפטידיים בטריפפטיד הזה. האובדן הזה כבר מובא בחשבון בשלוש מסות השיירים המשמשות בשלב 1.

כיצד להשתמש במחשבון המסה המולקולרית של חלבון

1. הזינו רצף באמצעות קודי חומצות אמינו סטנדרטיים בני אות אחת, למשל MVKMDVYKGSSIGDSMSRSM. אותיות גדולות וקטנות פועלות שתיהן.
2. המחשבון בודק את הרצף בזמן ההקלדה ומסמן כל תו שאינו אחד מ-20 הקודים הסטנדרטיים.
3. הוא מציג את המסה המולקולרית בדלטונים, את אורך הרצף ופירוט של הרכב חומצות האמינו.
4. אפשר להעתיק את התוצאות בלחיצה אחת למחברות מעבדה או לדוחות.

לפני הדבקת רצף ממסד נתונים כגון UniProt, הסירו את שורת הכותרת של FASTA (השורה המתחילה ב->) וכן מספרי מיקום מתוכנות ליישור רצפים. האותיות X, B, Z ו-J אינן קודי חומצות אמינו סטנדרטיים ויידחו; החליפו אותן בחומצת אמינו מסוימת לפני החישוב.

מדוע למסה המולקולרית של חלבון יש חשיבות

• אלקטרופורזה בג׳ל (SDS-PAGE): חלבונים קטנים מתחת ל-20 kDa זקוקים לג׳ל בעל אחוז גבוה יותר להפרדה טובה; חלבונים גדולים מעל 100 kDa זקוקים לאחוז נמוך יותר.
• סינון בג׳ל: טווח המסה המולקולרית של חלבון קובע איזה שרף בעמודה יפריד אותו כראוי.
• ספקטרומטריית מסות: משווים את המסה המחושבת למסה שנמדדה כדי לאשר את זהות החלבון או לזהות שינויים בלתי צפויים.
• סינתזת פפטידים: המסה המולקולרית קובעת את הכמות המדויקת של חומר המוצא הדרושה לכל שלב צימוד.
• חישובי בופר ומינון: המרה בין מולריות לריכוז לפי מסה דורשת את המסה המולקולרית.

מגבלות

המחשבון נותן מסה תאורטית המבוססת על הרצף בלבד. הוא אינו כולל:

• שינויים לאחר התרגום, כגון שרשראות הסוכר המתווספות בגליקוזילציה או קבוצות הפוספט המתווספות בזרחון. יש להוסיף אותם ידנית או למדוד אותם באמצעות ספקטרומטריית מסות.
• קשרים דיסולפידיים. כל קשר בין שני שיירי ציסטאין מסיר שני אטומי מימן, בערך 2.02 Da לכל קשר. המחשבון מניח שכל הציסטאינים אינם קשורים.
• חומצות אמינו שאינן סטנדרטיות, כגון סלנוציסטאין או פירוליזין, וכן שיירים שעברו שינוי כימי, כמו הידרוקסיפרולין.
• קופקטורים, כגון קבוצות הם או יוני מתכת הקשורים לחלבון.

שאלות נפוצות

מהי המסה המולקולרית של חלבון? זוהי המסה הכוללת של חלבון, הניתנת בדרך כלל בדלטונים (Da) או בקילודלטונים (kDa), כאשר 1 kDa שווים ל-1,000 Da. היא שווה לסכום מסות השיירים של חומצות האמינו ברצף, בתוספת מולקולת מים אחת עבור שני קצות השרשרת.

מדוע הנוסחה מוסיפה מים במקום להפחית אותם? יצירת קשר פפטידי משחררת מולקולת מים, ומסות השיירים המשמשות בסכימה כבר מחושבות לאחר הסרת המים האלה. מוסיפים מולקולת מים אחת בסוף רק כדי להביא בחשבון את אטום המימן החופשי ואת קבוצת ההידרוקסיל החופשית בשני קצות השרשרת המוגמרת.

עד כמה המסה המחושבת מדויקת? עבור חלבון ללא שינויים כימיים, החישוב מדויק ברמת הדיוק של מסות חומצות האמינו ששימשו, בדרך כלל בטווח של שבריר דלטון. חלבונים אמיתיים שעברו שינויים, כגון גליקוזילציה או יצירת קשרים דיסולפידיים, ישקלו כמות שונה מהערך המחושב.

האם המחשבון יכול לטפל בחומצות אמינו שעברו שינוי או שאינן סטנדרטיות? לא. הוא תומך רק ב-20 חומצות האמינו הסטנדרטיות. סלנוציסטאין, פירוליזין ושיירים אחרים שעברו שינוי אינם מזוהים, ויש לטפל בהם באמצעות תיקון ידני או כלי ייעודי.

כיצד ממירים דלטונים לקילודלטונים? חלקו ב-1,000. חלבון של 25,000 Da הוא 25 kDa. במאמרים מקובל להשתמש ב-Da עבור פפטידים קטנים וב-kDa עבור חלבונים גדולים יותר.

מדוע תוצאת הג׳ל או ספקטרומטריית המסות שלי אינה תואמת למסה המחושבת? הסיבות הנפוצות ביותר הן שינויים לאחר התרגום, קשרים דיסולפידיים או חלבון שנחתך לצורה בשלה קצרה יותר לאחר התרגום. סיבה נוספת היא אי-התאמה בין סוגי מסה. מחשבון זה מדווח על מסה מונואיזוטופית, המשתמשת באיזוטופ הקל ביותר של כל אטום. כלים רבים אחרים, כולל ExPASy ProtParam, מדווחים במקום זאת על מסה ממוצעת. המסה הממוצעת גבוהה יותר: מתחת ל-1 Da עבור פפטיד קצר, ובעשרות דלטונים עבור חלבון גדול. גם SDS-PAGE עלול להציג פס במיקום מטעה עבור חלבונים חומציים או בסיסיים מאוד, ולכן הוא מספק רק אומדן גס של המסה המולקולרית.