Kalkulator temperature sparivanja DNA | Besplatni PCR Tm alat

Što je kalkulator temperature annealiranja DNA?

Kalkulator temperature annealiranja DNA procjenjuje temperaturu taljenja (Tm) DNA početnice na temelju njezina slijeda. Tm je temperatura pri kojoj je polovica molekula početnice vezana za ciljnu nit, a polovica nije. U lančanoj reakciji polimerazom (PCR) ta vrijednost određuje temperaturu koja se upotrebljava za vezanje početnica na matricu DNA.

Zašto je temperatura annealiranja važna u PCR-u

PCR kopira ciljni dio DNA ponavljanim ciklusima zagrijavanja i hlađenja. Svaki ciklus ima tri koraka. Najprije se dvolančana matrica zagrijava na približno 95 °C, čime se razdvaja. Taj se korak naziva denaturacija. Zatim se reakcija hladi na temperaturu annealiranja, obično između 50 °C i 65 °C, kako bi se kratke početnice mogle vezati za komplementarne sljedove na jednostrukim nitima. U trećem koraku temperatura raste na približno 72 °C, a enzim nazvan DNA-polimeraza produljuje početnice i izgrađuje nove niti DNA.

Ako je temperatura annealiranja preniska, početnice se vežu za sljedove koji se samo djelomično podudaraju, pa nastaju dodatni neželjeni fragmenti DNA. Ako je previsoka, početnice ne mogu stvoriti stabilnu vezu s matricom te se kopira malo DNA ili se DNA uopće ne kopira. Temperatura annealiranja jedna je od prvih postavki koje istraživači prilagođavaju kada PCR reakcija ne uspije.

Kako sadržaj GC-a utječe na Tm

Početnica se s ciljem uparuje vodikovim vezama. Par gvanin-citozin (G-C) tvori tri vodikove veze. Par adenin-timin (A-T) tvori dvije. Početnici s više baza G i C potrebno je više topline za razdvajanje, pa ima viši Tm od početnice jednake duljine s više baza A i T. Sadržaj GC-a obično se zapisuje kao postotak: broj baza G i C podijeljen s ukupnom duljinom slijeda, pomnožen s 100.

Formula za temperaturu annealiranja DNA

Ovaj kalkulator primjenjuje jednu od dviju formula, odabranu prema duljini početnice.

Za početnice od 14 nukleotida ili dulje upotrebljava formulu Marmur-Doty za sadržaj GC-a:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

N_GC je broj baza G i C u početnici, izbrojen izravno, a ne izražen kao postotak. N je ukupan broj baza.

Za početnice kraće od 14 nukleotida upotrebljava Wallaceovo pravilo:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G i C označavaju broj baza te vrste u početnici.

Obje formule pretpostavljaju uobičajene uvjete PCR-a: približno 50 nanomola početnice i 50 milimola Na+.

Primjer izračuna

Uzmimo početnicu od 19 baza ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Njezina je duljina 19, što je 14 ili više, pa kalkulator upotrebljava formulu Marmur-Doty.

• Duljina (N) = 19
• Broj G = 5, broj C = 5, pa je N_GC = 10, a sadržaj GC-a iznosi 10 / 19 × 100 ≈ 52,6 %
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

Formula upotrebljava broj baza GC, 10, a ne postotak GC-a, 52,6. Pogrešna upotreba postotka daje Tm od približno 143 °C, što nije realna vrijednost za PCR reakciju koja se odvija između 50 °C i 95 °C.

Kako se upotrebljava ovaj kalkulator

Upišite ili zalijepite slijed početnice koji sadržava samo slova A, T, G i C. Kalkulator prikazuje duljinu slijeda u nukleotidima (nt), sadržaj GC-a kao postotak i izračunatu temperaturu annealiranja u Celzijevim stupnjevima. Rezultat se može kopirati u laboratorijske bilješke ili protokol.

Odabir temperature annealiranja za PCR

Tm je izračunata procjena, a ne zajamčena radna temperatura. Mnogi PCR protokoli započinju stvarni korak annealiranja nekoliko stupnjeva ispod izračunatog Tm-a, a zatim temperaturu prilagođavaju na temelju rezultata na gelu. Za par početnica obično se kao početna vrijednost upotrebljava niža od dviju vrijednosti Tm-a. Gradijentni PCR, pri kojem se istodobno izvodi nekoliko reakcija u rasponu temperatura, uobičajen je način pronalaženja najbolje temperature ispitivanjem.

Drugi načini procjene Tm-a

Ovdje uporabljene formule Marmur-Doty i Wallaceova formula brze su aproksimacije koje se temelje samo na sastavu baza. Postoje i druge metode:

• Termodinamika najbližih susjeda uzima u obzir kako svaki par susjednih baza utječe na stabilnost te se smatra točnijom metodom za standardne početnice.
• Formule korigirane za koncentraciju soli dodaju korekciju za koncentraciju iona Na+ ili K+ u reakcijskom puferu jer veća koncentracija soli stabilizira dvolančanu DNA i povećava Tm.

Različiti kalkulatori mogu prikazati različite vrijednosti Tm-a za istu početnicu jer upotrebljavaju različite formule. Provođenje PCR-a i provjera rezultata i dalje su konačni test.

Često postavljana pitanja

Što je temperatura annealiranja DNA?

To je temperatura pri kojoj se DNA početnice tijekom PCR-a vežu za komplementarni slijed na matrici. U laboratorijima se obično postavlja nekoliko stupnjeva ispod izračunate temperature taljenja (Tm) početnice.

Kako se izračunava Tm početnice?

Za početnice od 14 baza ili dulje, Tm = 64,9 + 41 × (broj baza GC − 16,4) / duljina. Za početnice kraće od 14 baza, Tm = 2 × (broj baza A+T) + 4 × (broj baza G+C).

Zašto sadržaj GC-a povećava Tm?

Parovi baza G-C tvore tri vodikove veze, u usporedbi s dvjema kod parova A-T. Početnici s većim udjelom baza G i C potrebno je više energije, a time i viša temperatura, za odvajanje od ciljnog slijeda.

Treba li temperatura annealiranja PCR-a biti jednaka izračunatom Tm-u?

Ne. Većina protokola započinje nekoliko stupnjeva ispod izračunatog Tm-a i zatim prilagođava temperaturu jer Tm označava točku u kojoj je vezana samo polovica početnice.

Mijenja li duljina početnice Tm?

Da, iako ne na jednostavan način. Duljina se u formuli Marmur-Doty nalazi u nazivniku, pa dulja početnica s prosječnim sadržajem GC-a nema automatski viši Tm od kraće početnice bogate GC-om.

Zašto se različiti kalkulatori Tm-a ne slažu?

Upotrebljavaju različite formule. Wallaceovo pravilo, formula Marmur-Doty za sadržaj GC-a, termodinamika najbližih susjeda i formule korigirane za koncentraciju soli mogu dati različite vrijednosti Tm-a za istu početnicu, ponekad s razlikom od nekoliko stupnjeva.

Reference

1. Marmur J, Doty P. Određivanje sastava baza deoksiribonukleinske kiseline na temelju njezine temperature toplinske denaturacije. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Hibridizacija sintetskih oligodeoksiribonukleotida s DNA phi chi 174. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. Jedinstveni prikaz termodinamike najbližih susjeda polimerne DNA, DNA u obliku bučice i oligonukleotidne DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.