Izračunajte precizne volumene uzoraka na temelju očitanja apsorpcije BCA ispitivanja i željene mase proteina. Bitno za dosljedno učitavanje proteina u western blotovima i drugim laboratorijskim aplikacijama.
Ovaj alat izračunava potrebni volumen uzorka na temelju rezultata BCA apsorbancije i mase uzorka. Unesite vrijednost apsorbancije i masu uzorka za svaki uzorak kako biste izračunali odgovarajući volumen uzorka.
Volumen uzorka se izračunava pomoću sljedeće formule:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
BCA Absorbance Sample Volume Calculator je specijalizovani alat dizajniran da pomogne istraživačima i laboratorijskim tehničarima da precizno odrede odgovarajući volumen uzorka za eksperimente na osnovu rezultata BCA (bicinchoninske kiseline) testa. Ovaj kalkulator uzima očitavanja apsorbancije iz vašeg BCA testa i vašu željenu masu uzorka kako bi izračunao tačan volumen potreban za dosledno učitavanje proteina u aplikacijama kao što su western blotting, enzimski testovi i druge tehnike analize proteina.
BCA test je jedna od najčešće korišćenih metoda za kvantifikaciju proteina u biokemijskim i molekularno-biološkim laboratorijama. Merenjem apsorbancije vaših uzoraka proteina i upoređivanjem sa standardnom krivom, možete odrediti koncentraciju proteina sa visokom tačnošću. Naš kalkulator pojednostavljuje ovaj proces automatski pretvarajući očitavanja apsorbancije u tačne volumene uzoraka potrebne za vaše eksperimente.
Bicinchoninska kiselina (BCA) test je biohemijska metoda za određivanje ukupne koncentracije proteina u rastvoru. Princip ove metode se oslanja na formiranje Cu²⁺-proteinskog kompleksa pod alkalnim uslovima, nakon čega dolazi do redukcije Cu²⁺ u Cu¹⁺. Količina redukcije je proporcionalna prisutnom proteinu. BCA formira ljubičasti kompleks sa Cu¹⁺ u alkalnim sredinama, pružajući osnovu za praćenje redukcije bakra od strane proteina.
Intenzitet ljubičaste boje se proporcionalno povećava sa koncentracijom proteina, što se može meriti pomoću spektrofotometra na približno 562 nm. Očitavanja apsorbancije se zatim upoređuju sa standardnom krivom kako bi se odredila koncentracija proteina u nepoznatim uzorcima.
Osnovna formula za izračunavanje volumena uzorka iz BCA rezultata apsorbancije je:
Gde:
Koncentracija proteina se izračunava iz očitavanja apsorbancije koristeći jednadžbu standardne krive:
Za standardni BCA test, tipični nagib je približno 2.0, a presjek je često blizu nule, iako se ove vrednosti mogu razlikovati u zavisnosti od vaših specifičnih uslova testa i standardne krive.
Naš kalkulator pojednostavljuje proces određivanja volumena uzoraka iz BCA rezultata apsorbancije. Pratite ove korake kako biste dobili tačne proračune:
Unesite informacije o uzorku:
Odaberite tip standardne krive:
Pogledajte rezultate:
Kopirajte ili izvezite rezultate:
Hajde da prođemo kroz praktičan primer:
To znači da treba da učitate 13.33 μL vašeg uzorka kako biste dobili 20 μg proteina.
Kalkulator pruža nekoliko važnih informacija:
Koncentracija proteina: Ovo se izračunava iz vašeg očitavanja apsorbancije koristeći odabranu standardnu krivu. Predstavlja količinu proteina po jedinici zapremine u vašem uzorku (μg/μL).
Volumen uzorka: Ovo je volumen vašeg uzorka koji sadrži vašu željenu količinu proteina. Ova vrednost je ono što ćete koristiti prilikom pripreme vaših eksperimenata.
Upozorenja i preporuke: Kalkulator može pružiti upozorenja za:
Jedna od najčešćih aplikacija za ovaj kalkulator je priprema uzoraka za western blotting. Dosledno učitavanje proteina je ključno za pouzdane rezultate western blota, a ovaj kalkulator osigurava da učitate istu količinu proteina za svaki uzorak, čak i kada se njihove koncentracije razlikuju.
Primer radnog toka:
Za enzimske testove, često je potrebno koristiti specifičnu količinu proteina kako bi se standardizovali uslovi reakcije između različitih uzoraka ili eksperimenata.
Primer radnog toka:
U eksperimentima imunoprecipitacije, započinjanje sa doslednom količinom proteina je važno za upoređivanje rezultata između različitih uslova.
Primer radnog toka:
Tokom čišćenja proteina, često je potrebno pratiti koncentraciju proteina i izračunati prinos na različitim koracima.
Primer radnog toka:
Iako kalkulator pruža podrazumevane parametre za standardne BCA testove, možete takođe uneti prilagođene vrednosti ako ste generisali svoju standardnu krivu. Ovo je posebno korisno kada:
Da biste koristili prilagođenu standardnu krivu:
Kalkulator vam omogućava da dodate više uzoraka i izračunate njihove volumene istovremeno. Ovo je posebno korisno kada pripremate uzorke za eksperimente koji zahtevaju dosledno učitavanje proteina između više uslova.
Prednosti obrade serija:
Ako je vaše očitavanje apsorbancije iznad 2.0, može biti van linearne oblasti BCA testa. U takvim slučajevima:
Za očitavanja apsorbancije ispod 0.1, možda ste blizu limita detekcije testa, što može uticati na tačnost. Razmotrite:
Ako kalkulator sugeriše volumen koji je prevelik za vašu aplikaciju:
Tačna kvantifikacija proteina je osnovni zahtev u biokemiji i molekularnoj biologiji otkako su se ova polja pojavila. Rane metode su se oslanjale na određivanje sadržaja azota, što je bilo vremenski zahtevno i zahtevalo specijalizovanu opremu.
Kjeldahlova metoda (1883): Jedna od najranijih metoda za kvantifikaciju proteina, zasnovana na merenju sadržaja azota.
Biuret test (rani 1900-ih): Ova metoda se oslanja na reakciju između peptidnih veza i jona bakra u alkalnom rastvoru, proizvodeći ljubičastu boju.
Lowry test (1951): Razvijen od strane Oliviera Lowryja, ova metoda kombinuje Biuret reakciju sa Folin-Ciocalteu reagensom, povećavajući osetljivost.
Bradford test (1976): Marion Bradford je razvila ovu metodu koristeći boju Coomassie Brilliant Blue G-250, koja se vezuje za proteine i pomera apsorpciju maksimuma.
BCA test (1985): Razvijen od strane Paula Smitha i njegovih kolega u Pierce Chemical Company, ova metoda je kombinovala Biuret reakciju sa BCA detekcijom, nudeći poboljšanu osetljivost i kompatibilnost sa deterdžentima.
BCA test je prvi put opisan u radu iz 1985. godine koji je napisao Smith i saradnici pod naslovom "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Razvijen je kako bi se adresirali nedostaci postojećih metoda, posebno ometanja od raznih hemikalija koje se često koriste u ekstrakciji i pročišćavanju proteina.
Ključna inovacija bila je korišćenje bicinchoninske kiseline za detekciju jona Cu¹⁺ koji su proizvedeni redukcijom Cu²⁺ od strane proteina, formirajući ljubičasti kompleks koji se može meriti spektrofotometrijski. Ovo je pružilo nekoliko prednosti:
Od svog uvođenja, BCA test je postao jedna od najšire korišćenih metoda kvantifikacije proteina u biokemijskim i molekularno-biološkim laboratorijama širom sveta.
1=IF(B2<=0,"Greška: Nevažeća apsorbancija",IF(C2<=0,"Greška: Nevažeća masa uzorka",C2/(2*B2)))
2
3' Gde:
4' B2 sadrži očitavanje apsorbancije
5' C2 sadrži željenu masu uzorka u μg
6' Formula vraća potrebni volumen uzorka u μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Izračunajte koncentraciju proteina iz apsorbancije koristeći standardnu krivu."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Apsorbancija ne može biti negativna")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Izračunajte potrebni volumen uzorka na osnovu apsorbancije i željene mase."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Masa uzorka mora biti pozitivna")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Izračunata koncentracija proteina mora biti pozitivna")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Primer korišćenja
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Za apsorbanciju {absorbance} i željenu masu proteina {sample_mass} μg:")
31 print(f"Koncentracija proteina: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Potreban volumen uzorka: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Greška: {e}")
351# Funkcija za izračunavanje koncentracije proteina iz apsorbancije
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Apsorbancija ne može biti negativna")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funkcija za izračunavanje volumena uzorka
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Masa uzorka mora biti pozitivna")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Izračunata koncentracija proteina mora biti pozitivna")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Primer korišćenja
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Za apsorbanciju %.2f i željenu masu proteina %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Koncentracija proteina: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Potreban volumen uzorka: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Greška: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Apsorbancija ne može biti negativna");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Masa uzorka mora biti pozitivna");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Izračunata koncentracija proteina mora biti pozitivna");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Primer korišćenja
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Za apsorbanciju ${absorbance} i željenu masu proteina ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Koncentracija proteina: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Potreban volumen uzorka: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Greška: ${error.message}`);
37}
38Odnos između apsorbancije i koncentracije proteina je obično linearan unutar određenog opsega. Ispod je vizualizacija standardne BCA krive:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Različite metode kvantifikacije proteina imaju razne prednosti i ograničenja. Evo kako se BCA test upoređuje sa drugim uobičajenim metodama:
| Metoda | Opseg osetljivosti | Prednosti | Ograničenja | Najbolje za |
|---|---|---|---|---|
| BCA test | 5-2000 μg/mL | • Kompatibilan sa deterdžentima • Manja varijacija između proteina • Stabilni razvoj boje | • Ometanje od redukcionih agenasa • Pogođen nekim agensima za chelaciju | • Opšta kvantifikacija proteina • Uzorci koji sadrže deterdžente |
| Bradford test | 1-1500 μg/mL | • Brzo (2-5 min) • Malo ometajućih supstanci | • Visoka varijacija između proteina • Nepodnosiv sa deterdžentima | • Brza merenja • Uzorci bez deterdženta |
| Lowry metoda | 1-1500 μg/mL | • Dobro uspostavljena • Dobra osetljivost | • Mnoge ometajuće supstance • Više koraka | • Istorijska doslednost • Čisti uzorci proteina |
| UV apsorbancija (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Nedestruktivno • Veoma brzo • Nema potrebnih reagenasa | • Pogođen nukleinskim kiselinama • Zahteva čiste uzorke | • Čista rešenja proteina • Brza provere tokom pročišćavanja |
| Fluorometrijska | 0.1-500 μg/mL | • Najveća osetljivost • Širok dinamički opseg | • Skupi reagensi • Zahteva fluorometar | • Veoma razređeni uzorci • Ograničeni volumen uzorka |
BCA (bicinchoninska kiselina) test se prvenstveno koristi za kvantifikaciju ukupne koncentracije proteina u uzorku. Široko se koristi u biokemiji, ćelijskoj biologiji i molekularnoj biologiji za aplikacije kao što su western blotting, enzimski testovi, imunoprecipitacija i pročišćavanje proteina.
BCA test je generalno tačan unutar 5-10% kada se pravilno izvrši. Njegova tačnost zavisi od nekoliko faktora uključujući kvalitet standardne krive, odsustvo ometajućih supstanci i da li je sastav nepoznatog proteina sličan standardnom proteinu koji se koristi.
Nekoliko supstanci može ometati rezultate BCA testa, uključujući:
Glavne razlike su:
Ako vaš kalkulator prikazuje vrlo veliki volumen, to obično ukazuje na nisku koncentraciju proteina u vašem uzorku. Ovo može biti zbog:
Razmotrite koncentrisanje vašeg uzorka ili prilagodite vaš eksperimentalni dizajn kako biste se prilagodili nižoj koncentraciji proteina.
Ovaj kalkulator je specifično dizajniran za rezultate BCA testa. Iako se osnovni princip (pretvaranje koncentracije u volumen) primenjuje na druge metode, odnos između apsorbancije i koncentracije proteina se razlikuje između različitih testova. Za druge metode kao što su Bradford ili Lowry, morali biste koristiti različite parametre standardne krive.
Za očitavanja apsorbancije van linearne oblasti (tipično >2.0):
Bovin serum albumin (BSA) je najčešće korišćeni standard za BCA testove jer je:
Međutim, ako vaši uzorci sadrže dominantan protein koji se značajno razlikuje od BSA, razmotrite korišćenje tog proteina kao vašeg standarda za tačnije rezultate.
Ljubičasta boja koja se razvija u BCA reakciji je stabilna nekoliko sati na sobnoj temperaturi i može se meriti u bilo kojem trenutku unutar tog perioda. Međutim, za najbolje rezultate preporučuje se merenje svih standarda i uzoraka otprilike u isto vreme nakon razvoja boje.
Iako je tehnički moguće ponovo koristiti standardnu krivu, to se ne preporučuje za tačnu kvantifikaciju. Varijacije u reagensima, uslovima inkubacije i kalibraciji instrumenta mogu uticati na odnos između apsorbancije i koncentracije proteina. Za pouzdane rezultate, generišite svežu standardnu krivu svaki put kada izvršite test.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Uputstvo. Dostupno na: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Sada kada razumete principe iza BCA kvantifikacije proteina i izračunavanja volumena uzorka, isprobajte naš kalkulator da pojednostavite vaš laboratorijski rad. Jednostavno unesite vaša očitavanja apsorbancije i željenu masu uzorka da biste dobili trenutne, tačne izračune volumena uzorka.
Bilo da pripremate uzorke za western blotting, enzimske testove ili bilo koju drugu eksperimentalnu tehniku zasnovanu na proteinima, naš kalkulator će pomoći da se osiguraju dosledni i pouzdani rezultati. Uštedite vreme, smanjite greške i poboljšajte ponovljivost vaših eksperimenata sa BCA Absorbance Sample Volume Calculator.
Otkrijte više alata koji bi mogli biti korisni za vaš radni proces