DNS Összekapcsolódási Hőmérséklet Kalkulátor | Ingyenes PCR Tm Eszköz
Számítsa ki a PCR optimális összekapcsolódási hőmérsékletét a primer szekvenciájából. Azonnali Tm számítás a Wallace-szabály alapján. Ingyenes eszköz GC-tartalom elemzéssel a pontos primer tervezéshez.
DNS Tapadási Hőmérséklet Kalkulátor
A DNS Tapadási Hőmérsékletről
Dokumentáció
Mi az a DNS-hibridizációshőmérséklet-kalkulátor?
A DNS-hibridizációshőmérséklet-kalkulátor a szekvenciája alapján megbecsüli egy DNS-primer olvadási hőmérsékletét (Tm). A Tm az a hőmérséklet, amelyen a primer molekuláinak fele a céltemplát-szálhoz kötődik, a másik fele pedig nem. Polimeráz-láncreakcióban (PCR) ez az érték segít meghatározni a primerek DNS-templáthoz való kötődéséhez használt hőmérsékletet.
Miért fontos a hibridizációs hőmérséklet a PCR-ben?
A PCR ismételt melegítési és hűtési ciklusokkal másolja a DNS egy célzott szakaszát. Minden ciklus három lépésből áll. Először a hő hatására a kettős szálú templát körülbelül 95 °C-on szétválik. Ezt a lépést denaturációnak nevezik. Másodszor a reakció lehűl a hibridizációs hőmérsékletre, általában 50 °C és 65 °C közé, hogy a rövid primerek az egyszálú szálakon található komplementer szekvenciákhoz kötődhessenek. Harmadszor a hőmérséklet körülbelül 72 °C-ra emelkedik, és egy DNS-polimeráz nevű enzim meghosszabbítja a primereket, létrehozva az új DNS-szálakat.
Ha a hibridizációs hőmérséklet túl alacsony, a primerek olyan szekvenciákhoz is kötődnek, amelyek csak részben egyeznek, így további nem kívánt DNS-fragmensek keletkeznek. Ha túl magas, a primerek nem tudnak stabil kötést kialakítani a templáttal, ezért kevés vagy egyáltalán semennyi DNS nem másolódik. A hibridizációs hőmérséklet az elsőként módosított beállítások egyike, ha egy PCR-reakció nem sikerül.
Hogyan befolyásolja a GC-tartalom a Tm-et?
A primer hidrogénkötéseken keresztül kapcsolódik a céljához. Egy guanin-citozin (G-C) bázispár három hidrogénkötést alkot. Egy adenin-timin (A-T) bázispár kettőt. A több G- és C-bázist tartalmazó primer szétszakításához több hő szükséges, ezért magasabb a Tm-je, mint egy azonos hosszúságú, több A- és T-bázist tartalmazó primeré. A GC-tartalmat általában százalékban adják meg: a G- és C-bázisok számát elosztják a teljes szekvenciahosszal, majd megszorozzák 100-zal.
A DNS hibridizációs hőmérsékletének képlete
Ez a kalkulátor a primer hosszától függően két képlet egyikét alkalmazza.
Legalább 14 nukleotid hosszúságú primerek esetén a Marmur–Doty-féle GC-tartalom-képletet használja:
Itt az N_GC a primerben található G- és C-bázisok száma, amelyet közvetlenül, nem százalékban számolnak. Az N a bázisok teljes száma.
A 14 nukleotidnál rövidebb primerek esetén a Wallace-szabályt használja:
Az A, T, G és C mindegyike az adott bázis primerbeli darabszámát jelöli.
Mindkét képlet szokásos PCR-feltételeket feltételez: körülbelül 50 nanomoláris primerkoncentrációt és 50 millimoláris Na+-koncentrációt.
Megoldott példa
Vegyük a 19 bázisból álló ATGCTAGCTAGCTGCTAGC primert. Hossza 19, ami legalább 14, ezért a kalkulátor a Marmur–Doty-képletet használja.
- Hossz (N) = 19
- G-k száma = 5, C-k száma = 5, ezért N_GC = 10, a GC-tartalom pedig 10 / 19 × 100 ≈ 52,6%
- Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C
A képlet a GC-bázisok számát, 10, nem pedig a GC-százalékot, 52,6 használja. Ha tévesen a százalékot használják, a Tm körülbelül 143 °C lesz, ami nem reális érték egy 50 °C és 95 °C között működő PCR-reakció esetén.
A kalkulátor használata
Írjon be vagy illesszen be egy primer-szekvenciát, amely csak az A, T, G és C betűket tartalmazza. A kalkulátor megjeleníti a szekvencia hosszát nukleotidokban (nt), a GC-tartalmat százalékban, valamint a számított hibridizációs hőmérsékletet Celsius-fokban. Az eredmény laboratóriumi feljegyzésekbe vagy protokollba másolható.
A PCR hibridizációs hőmérsékletének megválasztása
A Tm számított becslés, nem garantáltan működő hőmérséklet. Sok PCR-protokoll a tényleges hibridizációs lépést néhány fokkal a számított Tm alatt kezdi, majd a gélen kapott eredmény alapján módosítja. Primerpár esetén általában a két primer közül az alacsonyabb Tm-értéket használják kiindulási pontként. A gradiens-PCR, amely egyszerre több reakciót futtat egy hőmérséklet-tartományban, gyakori módszer a legjobb hőmérséklet teszteléssel történő meghatározására.
A Tm becslésének egyéb módszerei
Az itt használt Marmur–Doty- és Wallace-képletek gyors közelítések, amelyek kizárólag a bázisösszetételen alapulnak. Más módszerek is léteznek:
- A legközelebbi szomszédok termodinamikája figyelembe veszi, hogy az egymás mellett elhelyezkedő bázispárok hogyan befolyásolják a stabilitást, és standard primerek esetén ezt tekintik a pontosabb módszernek.
- A sókoncentrációval korrigált képletek korrekciót adnak a reakciópuffer Na+- vagy K+-ion-koncentrációjára, mivel a magasabb sókoncentráció stabilizálja a DNS kettős hélixét, és növeli a Tm-et.
Különböző kalkulátorok eltérő Tm-értékeket adhatnak ugyanarra a primerre, mert más-más képleteket használnak. A PCR lefuttatása és az eredmény ellenőrzése továbbra is a végső teszt.
Gyakran ismételt kérdések
Mi a DNS hibridizációs hőmérséklete?
Ez az a hőmérséklet, amelyen a DNS-primerek PCR közben a templátszálon található komplementer szekvenciához kötődnek. A laboratóriumok általában néhány fokkal a primer számított olvadási hőmérséklete (Tm) alatt állítják be.
Hogyan számítják ki a primer Tm-értékét?
Legalább 14 bázisból álló primerek esetén Tm = 64,9 + 41 × (GC-bázisok száma − 16,4) / hossz. 14 bázisnál rövidebb primerek esetén Tm = 2 × (A+T bázisok száma) + 4 × (G+C bázisok száma).
Miért növeli a GC-tartalom a Tm-et?
A G-C bázispárok három hidrogénkötést alkotnak, míg az A-T bázispárok kettőt. A nagyobb G- és C-bázisarányt tartalmazó primer szétválasztásához több energia, ezáltal magasabb hőmérséklet szükséges.
A PCR hibridizációs hőmérsékletének meg kell egyeznie a számított Tm-mel?
Nem. A legtöbb protokoll a számított Tm-nél több fokkal alacsonyabb hőmérsékleten kezdődik, majd onnan módosítják, mivel a Tm azt a pontot jelöli, ahol a primernek csak a fele kötődik.
Befolyásolja a primer hossza a Tm-et?
Igen, bár nem egyszerű módon. A hossz a Marmur–Doty-képlet nevezőjében szerepel, ezért egy átlagos GC-tartalmú, hosszabb primer Tm-je nem automatikusan magasabb, mint egy rövidebb, GC-ben gazdag primeré.
Miért térnek el egymástól a különböző Tm-kalkulátorok?
Különböző képleteket használnak. A Wallace-szabály, a Marmur–Doty-féle GC-tartalom-képlet, a legközelebbi szomszédok termodinamikai módszere és a sókoncentrációval korrigált képletek mind eltérő Tm-et adhatnak ugyanarra a primerre, esetenként több fok különbséggel.
Hivatkozások
- Marmur J, Doty P. A dezoxiribonukleinsav bázisösszetételének meghatározása termikus denaturációs hőmérsékletéből. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
- Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Szintetikus oligodezoxiribonukleotidok hibridizációja phi chi 174 DNS-hez. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
- SantaLucia J Jr. A polimer-, dumbbell- és oligonukleotid-DNS legközelebbi szomszédokra vonatkozó termodinamikájának egységes szemlélete. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.