Calcolatore della Legge di Beer-Lambert - Calcola l'Assorbanza Istantaneamente

Che cos'è la legge di Beer-Lambert?

La legge di Beer-Lambert è una formula che descrive la quantità di luce assorbita da una soluzione. Collega l'assorbanza a tre fattori: la concentrazione della soluzione, l'intensità con cui la sostanza disciolta assorbe la luce e la distanza percorsa dalla luce attraverso il campione. È chiamata anche legge di Beer. Un calcolatore della legge di Beer-Lambert applica questa formula per determinare assorbanza, trasmittanza e percentuale di luce assorbita a partire da pochi dati semplici.

La legge è uno strumento fondamentale della spettroscopia, lo studio del modo in cui la materia assorbe ed emette luce. Viene usata quotidianamente nei laboratori di chimica, biologia e medicina per misurare la concentrazione delle sostanze in una soluzione.

Formula della legge di Beer-Lambert

La legge di Beer-Lambert afferma:

$A = \varepsilon \times c \times l$

• A è l'assorbanza, cioè la quantità di luce che una soluzione assorbe a una determinata lunghezza d'onda. Non ha unità di misura.
• ε (epsilon) è l'assorbività molare, chiamata anche coefficiente di estinzione molare. Misura l'intensità con cui una sostanza assorbe la luce a una specifica lunghezza d'onda. Unità: L/(mol·cm).
• c è la concentrazione della sostanza, espressa in mol/L (molarità).
• l è il cammino ottico, cioè la distanza percorsa dalla luce attraverso il campione, espressa in cm.

L'assorbanza è correlata alla trasmittanza, cioè la frazione di luce che attraversa il campione:

$A = -\log_{10}(T)$

$T = 10^{-A}$

Qui T è la trasmittanza, un numero compreso tra 0 e 1. Moltiplicando T per 100 si ottiene la percentuale di luce trasmessa. La percentuale di luce assorbita è:

$\text{Percentuale assorbita} = (1 - T) \times 100\%$

Per esempio, un'assorbanza di 1,0 significa T = 0,1, quindi è stata assorbita 90% della luce. Un'assorbanza di 2,0 significa T = 0,01, quindi è stata assorbita 99%.

Come calcolare l'assorbanza

Per determinare l'assorbanza con il calcolatore, inserire tre valori:

1. Cammino ottico (l) — la larghezza del contenitore del campione, di solito una cuvetta. La maggior parte delle cuvette standard ha una larghezza di 1 cm, mentre alcune cuvette speciali hanno una larghezza di 0,1 cm o 10 cm.
2. Assorbività molare (ε) — una proprietà della sostanza specifica a una determinata lunghezza d'onda. Di solito si trova in tabelle di riferimento pubblicate oppure si calcola dalla struttura della molecola. Per esempio, le proteine assorbono la luce intorno a 280 nm a causa di due amminoacidi, triptofano e tirosina, e il valore esatto dipende dalla quantità di questi amminoacidi presenti nella proteina.
3. Concentrazione (c) — la quantità di sostanza disciolta, espressa in mol/L. Le concentrazioni indicate in altre unità, come mg/mL, devono prima essere convertite usando la massa molare della molecola.

Il calcolatore moltiplica i tre numeri per ottenere l'assorbanza, quindi ricava da quel risultato la trasmittanza e la percentuale assorbita.

Esempio svolto

Un ricercatore purifica una proteina e deve verificarne la concentrazione prima di eseguire un esperimento. L'assorbività molare della proteina a 280 nm è nota dalla sua sequenza: ε = 44.000 L/(mol·cm). Il ricercatore misura il campione in una cuvetta standard di 1 cm e rileva un'assorbanza pari a A = 0,523.

Riordinando la formula per risolvere rispetto alla concentrazione:

$c = \frac{A}{\varepsilon \times l} = \frac{0.523}{44{,}000 \times 1} = 1.19 \times 10^{-5} \text{ mol/L}$

Si tratta di 11,9 micromolare (μM). Questo valore rientra nell'intervallo in cui gli strumenti effettuano le letture con la maggiore accuratezza, quindi il ricercatore può fidarsi del risultato senza diluire ulteriormente il campione.

Interpretazione dei valori di assorbanza

• A = 0: nessuna luce assorbita a questa lunghezza d'onda.
• A = 0,3–0,9: l'intervallo in cui la maggior parte degli spettrofotometri fornisce letture lineari e accurate.
• A = 1,0: assorbimento del 90% della luce e trasmissione del 10%.
• A = 2,0: assorbimento del 99% e trasmissione del 1%.
• A superiore a 2,5: al di fuori dell'intervallo affidabile della maggior parte degli strumenti. Il campione deve essere diluito e misurato nuovamente.

Le letture inferiori a circa 0,3 sono influenzate dal rumore dello strumento. Le letture superiori a circa 1,5 sono influenzate da piccole quantità di luce parassita all'interno dello strumento, che introduce un errore. Diluire il campione e ripetere la misurazione è il metodo standard quando una lettura è al di fuori dell'intervallo di accuratezza.

Dove viene usata la legge di Beer-Lambert

Chimica analitica. I laboratori misurano l'assorbanza di un campione e usano la formula per calcolare a ritroso una concentrazione sconosciuta. È una procedura comune per analizzare i livelli di nitrati, fosfati e ioni metallici nell'acqua e per controllare la concentrazione di un lotto di sostanza chimica durante la produzione.

Biochimica. L'assorbanza a 280 nm permette di stimare la concentrazione delle proteine. L'assorbanza a 260 nm permette di stimare la concentrazione di DNA o RNA; per convenzione, un'assorbanza di 1,0 corrisponde a circa 50 μg/mL di DNA a doppio filamento o 40 μg/mL di RNA. Il rapporto tra le due letture (A260/A280) fornisce una misura approssimativa della purezza del campione.

Prodotti farmaceutici. Le aziende farmaceutiche usano le letture di assorbanza per verificare la rapidità con cui una compressa rilascia il principio attivo e per monitorare la degradazione di un farmaco durante la conservazione.

Medicina. Molti strumenti automatizzati per le analisi del sangue misurano l'assorbanza derivante da reazioni chimiche che cambiano colore, per determinare i livelli di glucosio, enzimi epatici e bilirubina.

Alimenti e bevande. Il colore della birra viene misurato tramite l'assorbanza a 430 nm secondo il metodo della European Brewery Convention (EBC). Metodi simili controllano il colore del vino e delle bevande analcoliche.

Limiti della legge di Beer-Lambert

La legge presuppone che la luce abbia una singola lunghezza d'onda ben definita e che il campione non diffonda la luce. Non è applicabile in alcune situazioni comuni:

• Concentrazione elevata. Al di sopra di circa 0,01 mol/L, le molecole disciolte iniziano a interagire tra loro e l'assorbanza non aumenta più linearmente con la concentrazione.
• Campioni torbidi o contenenti particelle. Le sospensioni e i liquidi torbidi diffondono la luce oltre ad assorbirla, facendo aumentare il valore misurato dell'assorbanza. La legge di Beer-Lambert non tiene conto della diffusione; per campioni opachi o diffusori, come le polveri, si usa un modello correlato chiamato teoria di Kubelka-Munk.
• Cambiamenti chimici durante la misurazione. Alcune sostanze si decompongono alla luce o cambiano con il pH durante la misurazione, modificando la lettura nel corso dell'analisi.
• Variazioni di temperatura. L'assorbività molare dipende dalla temperatura, quindi le letture effettuate a temperature non uniformi non sono direttamente confrontabili.

Storia

La legge si è sviluppata nell'arco di più di un secolo grazie al lavoro di tre scienziati. Pierre Bouguer descrisse nel 1729 come ogni strato di uguale spessore di un materiale assorba una frazione uguale della luce che lo attraversa. Johann Heinrich Lambert riformulò matematicamente questa relazione nel suo libro del 1760, Photometria, mostrando che l'assorbanza aumenta in proporzione diretta al cammino ottico. August Beer estese la legge nel 1852, mostrando che l'assorbanza aumenta anche in proporzione diretta alla concentrazione. La legge combinata è talvolta chiamata legge di Bouguer-Beer-Lambert, in riconoscimento di tutti e tre gli scienziati.

Domande frequenti

A cosa serve la legge di Beer-Lambert? Calcola la quantità di luce assorbita da una soluzione e permette di determinare a ritroso una concentrazione sconosciuta a partire da un'assorbanza misurata. Per questo è alla base della spettrofotometria UV-Vis, una tecnica di laboratorio comune per misurare la quantità di una sostanza in soluzione.

Quali unità usa la legge di Beer-Lambert? Il cammino ottico si esprime in centimetri, l'assorbività molare in L/(mol·cm) e la concentrazione in mol/L. L'assorbanza non ha unità di misura, anche se talvolta viene indicata con "AU", cioè unità di assorbanza. Inserire nella formula altre unità senza prima convertirle produce un risultato errato.

Perché la mia lettura dell'assorbanza non è proporzionale alla concentrazione? Le cause più comuni sono una concentrazione superiore a circa 0,01 mol/L, un campione torbido o contenente particelle, oppure una lettura molto al di fuori dell'intervallo 0,3–0,9, nel quale gli strumenti sono più accurati. Diluire il campione e ripetere la misurazione di solito permette di stabilire quale causa sia presente.

Qual è la differenza tra assorbanza e trasmittanza? La trasmittanza è la frazione di luce che attraversa un campione. L'assorbanza è il logaritmo negativo in base 10 della trasmittanza: A = −log₁₀(T). All'aumentare dell'assorbanza, la trasmittanza diminuisce.

Qual è la differenza tra assorbanza e densità ottica? Sono la stessa grandezza. "Densità ottica" è il termine usato più spesso in biologia, mentre "assorbanza" è più comune in chimica.

Qual è l'intervallo di assorbanza più accurato? Approssimativamente da 0,3 a 0,9. Al di sotto di questo intervallo, il rumore dello strumento prevale sul segnale. Al di sopra di circa 1,5, la luce parassita all'interno dello strumento introduce errori e, oltre circa 2,5, la maggior parte degli strumenti non è più in grado di fornire una lettura affidabile.

Riferimenti

1. Beer, A. (1852). "Bestimmung der Absorption des rothen Lichts in farbigen Flüssigkeiten." Annalen der Physik und Chemie, 86: 78–88.
2. Swinehart, D. F. (1962). "The Beer-Lambert Law." Journal of Chemical Education, 39(7): 333–335.
3. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., & Popp, J. (2020). "The Bouguer-Beer-Lambert Law: Shining Light on the Obscure." ChemPhysChem, 21(18): 2029–2046.