DNR Hibridizacijos Temperatūros Skaičiuoklė | Nemokamas PGR Tm Įrankis

Kas yra DNR atkaitinimo temperatūros skaičiuotuvas?

DNR atkaitinimo temperatūros skaičiuotuvas pagal seką apskaičiuoja DNR pradmens lydymosi temperatūrą (Tm). Tm yra temperatūra, kurioje pusė pradmens molekulių prisijungusios prie tikslinės grandinės, o kita pusė – ne. Atliekant polimerazės grandininę reakciją (PGR), ši reikšmė padeda parinkti temperatūrą, kurioje pradmenys prisijungia prie DNR matricos.

Kodėl atkaitinimo temperatūra svarbi atliekant PGR

PGR metu tikslinis DNR fragmentas kopijuojamas kartojant kaitinimo ir vėsinimo ciklus. Kiekvieną ciklą sudaro trys etapai. Pirmiausia, maždaug ties 95 °C, kaitinant atskiriama dvigrandė matrica. Šis etapas vadinamas denatūracija. Antra, reakcija atvėsinama iki atkaitinimo temperatūros, paprastai nuo 50 °C iki 65 °C, kad trumpi pradmenys galėtų prisijungti prie atitinkančių sekų viengrandėse grandinėse. Trečia, temperatūra pakeliama maždaug iki 72 °C, o fermentas, vadinamas DNR polimeraze, pailgina pradmenis ir sukuria naujas DNR grandines.

Jei atkaitinimo temperatūra per žema, pradmenys prisijungia prie tik iš dalies atitinkančių sekų, todėl susidaro papildomi nepageidaujami DNR fragmentai. Jei ji per aukšta, pradmenys negali stabiliai prisijungti prie matricos, todėl nukopijuojama mažai DNR arba ji visai nekopijuojama. Atkaitinimo temperatūra yra vienas iš pirmųjų parametrų, kuriuos tyrėjai koreguoja, kai PGR reakcija nepavyksta.

Kaip GC kiekis veikia Tm

Pradmuo su savo taikiniu jungiasi vandeniliniais ryšiais. Guanino ir citozino (G-C) pora sudaro tris vandenilinius ryšius. Adenino ir timino (A-T) pora sudaro du. Pradmeniui, kuriame yra daugiau G ir C bazių, atskirti reikia daugiau šilumos, todėl jo Tm yra aukštesnė nei tokio pat ilgio pradmens, kuriame yra daugiau A ir T bazių. GC kiekis paprastai išreiškiamas procentais: G ir C bazių skaičius dalijamas iš visos sekos ilgio ir dauginamas iš 100.

DNR atkaitinimo temperatūros formulė

Šis skaičiuotuvas taiko vieną iš dviejų formulių, pasirenkamų pagal pradmens ilgį.

Pradmenims, kuriuos sudaro 14 ar daugiau nukleotidų, taikoma Marmur-Doty GC kiekio formulė:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Čia N_GC yra tiesiogiai suskaičiuotas G ir C bazių skaičius pradmenyje, o ne jų procentinė dalis. N yra bendras bazių skaičius.

Trumpesniems nei 14 nukleotidų pradmenims taikoma Wallace taisyklė:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G ir C atitinkamai reiškia tos bazės skaičių pradmenyje.

Abi formulės daro prielaidą, kad PGR sąlygos yra įprastos: maždaug 50 nanomolių pradmens ir 50 milimolių Na+.

Išspręstas pavyzdys

Paimkime 19 bazių pradmenį ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Jo ilgis yra 19, t. y. 14 arba daugiau, todėl skaičiuotuvas taiko Marmur-Doty formulę.

• Ilgis (N) = 19
• G skaičius = 5, C skaičius = 5, taigi N_GC = 10, o GC kiekis yra 10 / 19 × 100 ≈ 52,6 %
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

Formulėje naudojamas GC skaičius, 10, o ne GC procentinė dalis, 52,6. Per klaidą naudojant procentinę dalį, gaunama maždaug 143 °C Tm, kuri nėra realistiška PGR reakcijai, vykdomai nuo 50 °C iki 95 °C temperatūroje.

Kaip naudotis šia skaičiuokle

Įrašykite arba įklijuokite pradmens seką, naudodami tik raides A, T, G ir C. Skaičiuotuvas rodo nukleotidų sekos ilgį (nt), GC kiekį procentais ir apskaičiuotą atkaitinimo temperatūrą Celsijaus laipsniais. Rezultatą galima nukopijuoti į laboratorijos užrašus arba protokolą.

PGR atkaitinimo temperatūros parinkimas

Tm yra apskaičiuotas įvertis, o ne garantuota tinkama darbinė temperatūra. Daugelyje PGR protokolų tikrasis atkaitinimo etapas pradedamas keliais laipsniais žemiau apskaičiuotos Tm, o vėliau temperatūra koreguojama pagal gelio rezultatą. Jei naudojama pradmenų pora, pradine reikšme paprastai pasirenkama mažesnė iš dviejų pradmenų Tm verčių. Atliekant gradientinę PGR, vienu metu vykdomos kelios reakcijos įvairiose temperatūrose; tai įprastas būdas bandant nustatyti tinkamiausią temperatūrą.

Kiti Tm įvertinimo būdai

Čia naudojamos Marmur-Doty ir Wallace formulės yra greiti apytiksliai metodai, pagrįsti vien bazių sudėtimi. Egzistuoja ir kitų metodų:

• Artimiausių kaimynų termodinamika atsižvelgia į tai, kaip kiekviena gretimų bazių pora veikia stabilumą, ir laikoma tikslesniu standartinių pradmenų metodu.
• Druskos koncentracijai pritaikytos formulės įtraukia Na+ arba K+ jonų koncentracijos reakcijos buferyje pataisą, nes didesnė druskos koncentracija stabilizuoja DNR dvigrandę ir padidina Tm.

Skirtingi skaičiuotuvai tam pačiam pradmeniui gali pateikti skirtingas Tm vertes, nes taiko skirtingas formules. PGR atlikimas ir rezultato patikrinimas lieka galutiniu bandymu.

Dažnai užduodami klausimai

Kas yra DNR atkaitinimo temperatūra?

Tai temperatūra, kurioje PGR metu DNR pradmenys jungiasi prie juos atitinkančios sekos matricos grandinėje. Laboratorijose ji paprastai nustatoma keliais laipsniais žemiau apskaičiuotos pradmens lydymosi temperatūros (Tm).

Kaip apskaičiuojama pradmens Tm?

14 bazių arba ilgesniems pradmenims Tm = 64,9 + 41 × (GC skaičius − 16,4) / ilgis. Trumpesniems nei 14 bazių pradmenims Tm = 2 × (A+T skaičius) + 4 × (G+C skaičius).

Kodėl GC kiekis didina Tm?

G-C bazių poros sudaro tris vandenilinius ryšius, o A-T poros – du. Pradmeniui, kuriame yra didesnė G ir C bazių dalis, atsiskirti nuo savo taikinio reikia daugiau energijos, taigi ir aukštesnės temperatūros.

Ar PGR atkaitinimo temperatūra turi būti lygi apskaičiuotai Tm?

Ne. Dauguma protokolų pradedami keliais laipsniais žemiau apskaičiuotos Tm, o vėliau temperatūra koreguojama, nes Tm žymi tašką, kuriame prisijungusi yra tik pusė pradmens.

Ar pradmens ilgis keičia Tm?

Taip, tačiau ne paprastai. Marmur-Doty formulėje ilgis yra vardiklyje, todėl ilgesnis pradmuo, kurio GC kiekis vidutinis, automatiškai neturės didesnės Tm nei trumpesnis pradmuo, kuriame gausu GC.

Kodėl skirtingi Tm skaičiuotuvai pateikia skirtingus rezultatus?

Jie taiko skirtingas formules. Wallace taisyklė, Marmur-Doty GC kiekio formulė, artimiausių kaimynų termodinamika ir druskos koncentracijai pritaikytos formulės tam pačiam pradmeniui gali pateikti skirtingą Tm, kartais kelių laipsnių skirtumu.

Šaltiniai

1. Marmur J, Doty P. Deoksiribonukleorūgšties bazių sudėties nustatymas pagal terminės denatūracijos temperatūrą. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Sintetinių oligodeoksiribonukleotidų hibridizacija su phi chi 174 DNR. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. Vieningas polimerų, „svarmenėlio“ ir oligonukleotidų DNR artimiausių kaimynų termodinamikos požiūris. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.