DNR Kopijų Skaičiuoklė | Genominis Analizės Įrankis

DNR kopijų skaičiaus skaičiuoklė

DNR kopijų skaičiaus skaičiuoklė įvertina, kiek tikslinės sekos kopijų yra DNR mėginyje. Ji remiasi mėginio koncentracija, jo tūriu ir tuo, kiek kartų tikslinė seka pasikartoja ilgesnėje DNR sekoje. Molekulinės biologijos laboratorijos tokį įvertį naudoja planuodamos tokius eksperimentus kaip qPCR (kiekybinė polimerazės grandininė reakcija) prieš atlikdamos brangesnį ir tikslesnį tyrimą.

Ką reiškia DNR kopijų skaičius

DNR kopijų skaičius – tai, kiek kartų tam tikra seka pasirodo genome arba mėginyje. Įprastas žmogaus genas pasirodo du kartus: po vieną kopiją paveldima iš kiekvieno iš tėvų. Šį skaičių gali pakeisti keli veiksniai.

• Amplifikacija: daugiau nei dvi kopijos. Vėžinės ląstelės dažnai amplifikuoja augimą skatinančius genus, pavyzdžiui, HER2 kai kuriuose krūties navikuose.
• Delecija: mažiau nei dvi kopijos, kartais nė vienos. Delecijos gali sukelti genetinius sutrikimus.
• Duplikacija: atsiranda papildoma kopija ten, kur turėtų būti tik viena arba dvi.
• Kopijų skaičiaus variacija (CNV): normalus kopijų skaičiaus skirtumas tarp individų, aptinkamas reikšmingoje žmogaus genomo dalyje.

DNR kopijų skaičiaus formulė

Skaičiuoklė paverčia sekos pasikartojimų skaičių ir mėginio masę į kopijų skaičių pagal šią formulę:

$\text{Kopijų skaičius} = \frac{\text{Pasikartojimų skaičius} \times \text{Koncentracija} \times \text{Tūris} \times N_A}{\text{DNR ilgis} \times 660 \times 10^{9}}$

Kur:

• Pasikartojimų skaičius — kiek kartų tikslinė seka pasirodo visoje DNR sekoje, atskirai skaičiuojant ir persidengiančius atitikmenis.
• Koncentracija — DNR koncentracija nanogramais mikrolitre (ng/μL), paprastai nustatoma spektrofotometru arba fluorometru.
• Tūris — mėginio tūris mikrolitrais (μL).
• $N_A$ — Avogadro skaičius, 6,022 × 10²³ molekulių molyje. Jis perskaičiuoja DNR molių skaičių į molekulių skaičių.
• DNR ilgis — visos DNR sekos ilgis bazių poromis.
• 660 — vienos DNR bazės poros vidutinė molekulinė masė gramais vienam moliui (g/mol). Bazių porą sudaro du susiporavę nukleotidai, po vieną iš kiekvienos DNR grandinės.
• 10⁹ — perskaičiuoja nanogramus į gramus.

Formulė pirmiausia perskaičiuoja mėginio masę į DNR molekulių molių skaičių, padaugina iš Avogadro skaičiaus, kad gautų bendrą DNR molekulių skaičių mėginyje, tada padaugina iš to, kiek kartų tikslinė seka pasikartoja kiekvienoje molekulėje.

Įrankis priima tik raides A, T, C ir G. Tarpai ir eilučių lūžiai ignoruojami, o mažosios raidės laikomos lygiavertėmis didžiosioms.

Kaip apskaičiuoti DNR kopijų skaičių: praktinis pavyzdys

Paimkime 12 bazių porų DNR seką ATCGATCGATCG, kurios tikslinė seka yra ATCG, koncentracija – 10 ng/μL, o tūris – 20 μL.

1 žingsnis: suskaičiuokite pasikartojimus. ATCG sekoje ATCGATCGATCG pasirodo 3 kartus: pozicijose 1, 5 ir 9.

2 žingsnis: nustatykite bendrą DNR masę. Koncentracija × tūris = 10 × 20 = 200 ng.

3 žingsnis: perskaičiuokite į molius. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Padalijus iš (12 bazių porų × 660 g/mol) = 7 920 g/mol, gaunama 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

4 žingsnis: perskaičiuokite į molekulių skaičių. Padauginkite iš Avogadro skaičiaus: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ molekulių/mol ≈ 1,52 × 10¹³ DNR molekulių.

5 žingsnis: padauginkite iš pasikartojimų skaičiaus. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, arba maždaug 45 621 212 121 212 kopijų.

Šis skaičius atrodo milžiniškas, nes 20 μL mėginyje, kurio koncentracija 10 ng/μL, vis tiek yra trilijonai trumpų DNR molekulių. Tikruose mėginiuose paprastai naudojamos daug ilgesnės sekos, todėl esant tokiai pačiai masei molekulių skaičius yra mažesnis.

Kur naudojama DNR kopijų skaičiaus analizė

Vėžio diagnostika. Patologijos laboratorijos tikrina HER2 kopijų skaičių krūties naviko audinyje. Normali ląstelė turi dvi kopijas. Amplifikuotame navike gali būti šešios ar daugiau kopijų, o tai turi įtakos tinkamumui gydyti taikininiais vaistais, tokiais kaip trastuzumabas.

Genetinių ligų tyrimai. Tokios būklės kaip DiGeorge'o sindromas yra susijusios su chromosomos segmento delecija. Dauno sindromą lemia papildoma 21 chromosomos kopija (21 trisomija). Kopijų skaičiavimas padeda patvirtinti šias diagnozes.

Transgenų ir plazmidžių kiekybinis nustatymas. Tyrėjai tikrina, kiek įterpto geno kopijų pateko į augalo, gyvūno arba bakterijos ląstelę. Paprastai pageidaujama vienos kopijos, nes kelios kopijos gali paskatinti ląstelę nutildyti geną.

Patogenų ir virusų kiekio stebėjimas. Kopijų skaičiaus įverčiai parodo, kiek virusinės arba bakterinės DNR yra mėginyje; tai naudojama infekcijoms stebėti ir aplinkos tyrimams.

Kiti kopijų skaičiaus matavimo metodai

Ši skaičiuoklė pateikia greitą įvertį pagal sekos ir koncentracijos duomenis. Laboratorijos, kurioms reikia didesnio tikslumo, paprastai renkasi vieną iš šių metodų:

• Kiekybinė PGR (qPCR): amplifikuoja ir realiuoju laiku matuoja DNR; naudojant gerą standartinę kreivę, tikslumas siekia maždaug 15–20%.
• Skaitmeninė PGR (dPCR): padalija mėginį į tūkstančius mažų reakcijų, kad būtų galima tiesiogiai suskaičiuoti, nenaudojant standartinės kreivės.
• Fluorescencinė in situ hibridizacija (FISH): tiesiogiai ląstelėse arba chromosomose mikroskopu vizualiai suskaičiuoja sekas; tai yra standartinis metodas daugelyje vėžio diagnostikos laboratorijų.
• Naujos kartos sekoskaita (NGS): nustato viso mėginio seką ir vienu metu profiliuoja kopijų skaičių visame genome.

Dažnai užduodami klausimai

Kas yra DNR kopijų skaičius? Tai, kiek kartų tam tikra DNR seka pasirodo genome arba mėginyje. Dauguma žmogaus genų pasirodo du kartus – po vieną kopiją iš kiekvieno iš tėvų. Papildomos arba trūkstamos kopijos gali turėti įtakos sveikatai ir ligų rizikai.

Koks šios skaičiuoklės tikslumas? Ji pateikia teorinį įvertį pagal įvestus duomenis, o ne laboratorinio matavimo rezultatą. Tikslumas priklauso nuo to, kaip tiksliai išmatuota koncentracija ir kiek specifiška yra tikslinė seka. Tokie metodai kaip skaitmeninė PGR yra tikslesni skelbiamiems rezultatams gauti.

Ar šią skaičiuoklę galima naudoti RNR? Ne. RNR vietoj timino naudoja uracilą ir kitokį cukrų, todėl jos molekulinė masė skiriasi nuo DNR molekulinės masės. Vidutinė RNR santykinė molekulinė masė yra apie 330 g/mol vienam nukleotidui, o DNR bazių poros – apie 660 g/mol. Taikant DNR formulę RNR duomenims būtų gautas neteisingas atsakymas.

Kodėl persidengianti seka skaičiuojama daugiau nei vieną kartą? Skaičiuoklė skaičiuoja kiekvieną poziciją, kurioje tikslinė seka sutampa, net jei sutampančios sekos turi bendrų raidžių. Sekoje ATATAT seka ATA sutampa du kartus – pozicijoje 1 ir pozicijoje 3, nes kiekviena pradžios pozicija tikrinama atskirai.

Koks DNR koncentracijos intervalas tinkamiausias? Koncentracijos nuo 10–100 ng/μL užtikrina patikimiausius standartiniais laboratoriniais prietaisais gaunamus rodmenis. Kai koncentracija mažesnė nei 10 ng/μL, matavimo paklaida didėja, todėl vietoj standartinio spektrofotometro rekomenduojama naudoti jautresnį metodą, pavyzdžiui, fluorometrą.

Ar ši skaičiuoklė gali įvertinti plazmidės kopijų skaičių? Taip. Kaip DNR seką įveskite visą plazmidės seką, o kaip tikslinę seką – unikalų intarpo regioną, taip pat nurodykite išmatuotą plazmidės koncentraciją ir mėginio tūrį.