Baltymų Koncentracijos Skaičiuoklė | A280 į mg/mL

Baltymų koncentracijos skaičiuoklė

Baltymų koncentracijos skaičiuoklė spektrofotometru išmatuotą šviesos sugertį perskaičiuoja į tirpale ištirpusio baltymo kiekį. Rezultatas paprastai pateikiamas miligramais mililitre (mg/mL) arba mikrogramais mililitre (μg/mL). Skaičiavimas grindžiamas Beerio ir Lamberto dėsniu – chemijos sąryšiu, siejančiu mėginio sugertos šviesos kiekį su jame esančios medžiagos kiekiu.

Kaip matuojama baltymų koncentracija

Dauguma baltymų stipriai sugeria ultravioletinę šviesą, kurios bangos ilgis yra 280 nanometrų (nm). Šią sugertį daugiausia lemia dvi baltymo struktūroje esančios aminorūgštys – triptofanas ir tirozinas. Spektrofotometras siunčia šviesą per mėginį ir matuoja, kiek jos mėginys sugeria. Šis rodmuo vadinamas sugertimi arba A280, kai matuojama esant 280 nm bangos ilgiui.

Sugerties matavimas esant 280 nm bangos ilgiui yra greitas ir nesunaikina mėginio. Tuo jis skiriasi nuo toliau aprašytų cheminių metodų, pavyzdžiui, Bradfordo arba BCA tyrimo. Šis metodas geriausiai tinka išgrynintam tirpale esančiam baltymui, kai sugerties rodmuo yra maždaug nuo 0,1 iki 1,0. Už šio intervalo ribų rodmenys yra mažiau patikimi, todėl prieš matuojant mėginį dažnai reikia praskiesti.

Baltymų koncentracijos formulė

Skaičiuoklė pertvarko Beerio ir Lamberto dėsnį, kad būtų galima apskaičiuoti koncentraciją:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — baltymų koncentracija mg/mL
• A — sugertis esant 280 nm bangos ilgiui (paprastas skaičius be matavimo vieneto)
• DF — praskiedimo koeficientas, rodantis, kiek kartų pradinis mėginys buvo praskiestas prieš jį išmatuojant
• ε — savitasis ekstinkcijos koeficientas, baltymui būdinga konstanta, išreiškiama L/(g·cm)
• l — optinio kelio ilgis, tai yra atstumas, kurį šviesa nueina per mėginį, išreiškiamas cm (standartinėje kiuvetėje, mažame spektrofotometre naudojamame stikliniame arba plastikiniame indelyje, paprastai 1 cm)

Norėdami perskaičiuoti rezultatą į mikrogramus mililitre, mg/mL reikšmę padauginkite iš 1 000. Norėdami nustatyti bendrą mėginyje esančio baltymo masę, koncentraciją padauginkite iš mėginio tūrio mililitrais.

Išspręstas pavyzdys

Mėginio sugerties rodmuo yra 0,5, išmatuotas esant 280 nm bangos ilgiui. Mėginys nebuvo praskiestas, todėl praskiedimo koeficientas yra 1, o matavimas atliktas standartinėje 1 cm kiuvetėje. Baltymas yra galvijų serumo albuminas (BSA), kurio ekstinkcijos koeficientas yra 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

1 mL mėginyje tai sudaro maždaug 0,75 mg bendro baltymo arba 750 μg/mL.

Dažniausių baltymų ekstinkcijos koeficientai

Kiekvienas baltymas šviesą sugeria skirtingai, nes kiekviename yra skirtingas triptofano ir tirozino liekanų skaičius. Ekstinkcijos koeficientas apibūdina, kiek šviesos sugeria konkretus baltymas esant 280 nm bangos ilgiui; jis išreiškiamas L/(g·cm). Dažniausiai naudojamos reikšmės:

Skaičiuoklė taip pat gali naudoti pasirinktinį baltymo, kurio šiame sąraše nėra, ekstinkcijos koeficientą. Baltymui, kurio aminorūgščių seka žinoma, šią reikšmę galima įvertinti pagal Gillio ir von Hippelio 1989 m. paskelbtą formulę: ε₂₈₀ = (triptofano liekanų skaičius × 5 500) + (tirozino liekanų skaičius × 1 490) + (cisteino liekanų skaičius × 125). Ši formulė pateikia rezultatą M⁻¹cm⁻¹ vienetais, t. y. moliniu vienetu, kuris skiriasi nuo pirmiau nurodytų masės pagrindu pateikiamų L/(g·cm) reikšmių. Nemokami įrankiai, tokie kaip „ProtParam“, pasiekiami per „ExPASy“ serverį, šią reikšmę apskaičiuoja tiesiogiai pagal baltymo seką.

Optinis kelias ir praskiedimo koeficientas

Optinis kelias yra mėginį laikančios kiuvetės plotis, matuojamas centimetrais. Standartinių kiuvečių plotis yra 1 cm. Mažo tūrio spektrofotometrais, kuriais matuojami labai maži mėginiai, gali būti naudojamas daug trumpesnis optinis kelias, pavyzdžiui, 0,1 cm.

Praskiedimo koeficientas atsižvelgia į bet kokį prieš matavimą atliktą praskiedimą. Jei koncentruoto mėginio sugertis būtų didesnė nei 1,0, įprasta pirmiausia jį praskiesti buferiu. Praskiedimo koeficientas lygus bendro praskiesto tūrio ir pradinio mėginio tūrio santykiui. Pavyzdžiui, sumaišius 10 μL mėginio su 990 μL buferio, bendras tūris yra 1 000 μL, o praskiedimo koeficientas – 100.

Kiti baltymų koncentracijos matavimo būdai

Sugerties matavimas esant 280 nm bangos ilgiui yra vienas iš kelių laboratorijoje dažnai taikomų metodų.

• Bradfordo tyrimas: naudojami dažai, kurių spalva pasikeičia jiems prisijungus prie baltymo. Šis metodas gerai tinka neišgrynintiems mėginiams, tačiau spalvos pokytis gali skirtis priklausomai nuo baltymo.
• BCA tyrimas: grindžiamas spalvos pokyčiu, kurį sukelia baltymo peptidiniai ryšiai. Jis suderinamas su daugeliu detergentų, tačiau atliekamas ilgiau nei tiesioginis sugerties matavimas.
• Lowry metodas: senesnis, labai jautrus metodas, tačiau su kai kuriomis įprastomis buferio sudedamosiomis dalimis reaguoja prastai.

Visi šie trys metodai sunaikina mėginį. Tiesioginis A280 matavimas mėginio nesunaikina, todėl tą patį mėginį galima susigrąžinti ir panaudoti dar kartą.

Dažnai užduodami klausimai

Koks yra idealus šio metodo sugerties intervalas?

Nuo 0,1 iki 1,0. Mažesnis nei 0,1 rodmuo yra netikslus. Viršijus 1,0, ryšys tarp sugerties ir koncentracijos gali nebebūti tiesinis, todėl mėginį pirmiausia reikėtų praskiesti.

Kodėl matuojama esant 280 nm, o ne 260 nm bangos ilgiui?

Nukleorūgštys, pavyzdžiui, DNR ir RNR, stipriai sugeria šviesą esant 260 nm bangos ilgiui. Baltymai dėl juose esančio triptofano ir tirozino labiau sugeria esant 280 nm bangos ilgiui. Matavimas esant 280 nm bangos ilgiui sumažina mėginyje esančių nukleorūgščių trukdžius.

Kaip nustatomas į sąrašą neįtraukto baltymo ekstinkcijos koeficientas?

Jei baltymo seka žinoma, toks įrankis kaip „ProtParam“ koeficientą apskaičiuoja pagal triptofano, tirozino ir cistino liekanų skaičių. Jį taip pat galima išmatuoti tiesiogiai, lyginant mėginio sugertį su žinomos koncentracijos tirpalu.

Ar šis metodas tinka baltymų mišiniui?

Jis geriausiai tinka vienam išgrynintam baltymui, kurio ekstinkcijos koeficientas žinomas. Nežinomų baltymų mišinys, pavyzdžiui, ląstelių lizatas, paprastai matuojamas Bradfordo arba BCA tyrimu, nes šie metodai leidžia nuosekliau įvertinti bendrą baltymų kiekį.

Ar detergentai gali trukdyti matuoti?

Taip. Daugelis detergentų sugeria šviesą netoli 280 nm bangos ilgio, todėl rezultatas gali būti iškraipytas. Naudojant tuščiąjį mėginį, kuriame yra tokia pati detergento koncentracija, galima kompensuoti šią foninę sugertį. Esant labai didelei detergentų koncentracijai gali reikėti su detergentais suderinamo tyrimo, pavyzdžiui, BCA.