Beer-Lambert Wet Calculator - Bereken Absorptie Direct

Wat is de wet van Beer-Lambert?

De wet van Beer-Lambert is een formule die beschrijft hoeveel licht een oplossing absorbeert. De wet koppelt de absorbantie aan drie zaken: de concentratie van de oplossing, de sterkte waarmee de opgeloste stof licht absorbeert en de afstand die het licht door het monster aflegt. De wet wordt ook de wet van Beer genoemd. Een calculator voor de wet van Beer-Lambert past deze formule toe om op basis van enkele eenvoudige invoergegevens de absorbantie, transmissie en het percentage geabsorbeerd licht te bepalen.

De wet is een belangrijk hulpmiddel in de spectroscopie, de studie van de manier waarop materie licht absorbeert en uitzendt. In chemische, biologische en medische laboratoria wordt de wet dagelijks gebruikt om de concentratie van stoffen in een oplossing te meten.

Formule van de wet van Beer-Lambert

De wet van Beer-Lambert luidt:

$A = \varepsilon \times c \times l$

• A is de absorbantie: de hoeveelheid licht die een oplossing bij een bepaalde golflengte absorbeert. De grootheid heeft geen eenheid.
• ε (epsilon) is de molaire absorptiviteit, ook wel de molaire extinctiecoëfficiënt genoemd. Deze geeft aan hoe sterk een stof licht absorbeert bij een specifieke golflengte. Eenheid: L/(mol·cm).
• c is de concentratie van de stof, uitgedrukt in mol/L (molariteit).
• l is de padlengte: de afstand die het licht door het monster aflegt, uitgedrukt in cm.

Absorbantie houdt verband met transmissie, de fractie van het licht die door het monster heen gaat:

$A = -\log_{10}(T)$

$T = 10^{-A}$

Hierbij is T de transmissie, een getal tussen 0 en 1. Door T met 100 te vermenigvuldigen, krijgt men het percentage doorgelaten licht. Het percentage geabsorbeerd licht is:

$\text{Percentage geabsorbeerd} = (1 - T) \times 100\%$

Een absorbantie van 1,0 betekent bijvoorbeeld dat T = 0,1, dus dat 90% van het licht werd geabsorbeerd. Een absorbantie van 2,0 betekent dat T = 0,01, dus dat 99% werd geabsorbeerd.

Absorbantie berekenen

Voer om de absorbantie met de calculator te bepalen drie waarden in:

1. Optische weglengte (l) — de breedte van de monsterhouder, meestal een cuvet. De meeste standaardcuvetten zijn 1 cm breed, maar sommige gespecialiseerde cuvetten zijn 0,1 cm of 10 cm breed.
2. Molaire absorptiviteit (ε) — een eigenschap van de specifieke stof bij een specifieke golflengte. Deze waarde staat meestal in gepubliceerde referentietabellen of wordt berekend op basis van de structuur van een molecuul. Eiwitten absorberen bijvoorbeeld licht rond 280 nm door de aminozuren tryptofaan en tyrosine; de exacte waarde hangt af van het aantal van deze aminozuren in een eiwit.
3. Concentratie (c) — de hoeveelheid opgeloste stof, uitgedrukt in mol/L. Concentraties in andere eenheden, zoals mg/mL, moeten eerst worden omgerekend met behulp van de molaire massa van het molecuul.

De calculator vermenigvuldigt de drie getallen om de absorbantie te verkrijgen en leidt vervolgens uit dat resultaat de transmissie en het percentage geabsorbeerd licht af.

Uitgewerkt voorbeeld

Een onderzoeker zuivert een eiwit en moet de concentratie ervan controleren voordat een experiment wordt uitgevoerd. De molaire absorptiviteit van het eiwit bij 280 nm is op basis van de sequentie bekend: ε = 44.000 L/(mol·cm). De onderzoeker meet het monster in een standaardcuvet van 1 cm en meet een absorbantie van A = 0,523.

De formule herschikken om de concentratie te berekenen:

$c = \frac{A}{\varepsilon \times l} = \frac{0.523}{44{,}000 \times 1} = 1.19 \times 10^{-5} \text{ mol/L}$

Dat is 11,9 micromolair (μM). Dit valt binnen het bereik waarin instrumenten het nauwkeurigst meten, zodat de onderzoeker de waarde kan vertrouwen zonder het monster verder te verdunnen.

Absorbantiewaarden interpreteren

• A = 0: bij deze golflengte wordt geen licht geabsorbeerd.
• A = 0,3 tot 0,9: het bereik waarin de meeste spectrofotometers de nauwkeurigste, lineaire metingen geven.
• A = 1,0: 90% van het licht wordt geabsorbeerd en 10% doorgelaten.
• A = 2,0: 99% wordt geabsorbeerd en 1% doorgelaten.
• A hoger dan 2,5: buiten het betrouwbare bereik van de meeste instrumenten. Het monster moet worden verdund en opnieuw gemeten.

Metingen onder ongeveer 0,3 worden beïnvloed door instrumentruis. Metingen boven ongeveer 1,5 worden beïnvloed door kleine hoeveelheden strooilicht in het instrument, wat fouten veroorzaakt. Een monster verdunnen en opnieuw meten is de standaardoplossing wanneer een meting buiten het nauwkeurige bereik valt.

Toepassingen van de wet van Beer-Lambert

Analytische chemie. Laboratoria meten de absorbantie van een monster en gebruiken de formule om een onbekende concentratie terug te berekenen. Dit gebeurt vaak bij het bepalen van nitraat-, fosfaat- en metaaliongehalten in water en bij het controleren van de concentratie van een chemische productiebatch.

Biochemie. Absorbantie bij 280 nm geeft een schatting van de eiwitconcentratie. Absorbantie bij 260 nm geeft een schatting van de DNA- of RNA-concentratie; volgens afspraak komt een absorbantie van 1,0 overeen met ongeveer 50 μg/mL dubbelstrengs-DNA of 40 μg/mL RNA. De verhouding tussen de twee metingen (A260/A280) geeft een globale maat voor de zuiverheid van het monster.

Farmaceutische industrie. Geneesmiddelenfabrikanten gebruiken absorbantiemetingen om te bepalen hoe snel een tablet de werkzame stof afgeeft en om te volgen hoe een geneesmiddel tijdens opslag in de loop der tijd afbreekt.

Geneeskunde. Veel geautomatiseerde bloedanalyseapparaten meten de absorbantie van kleurveranderende chemische reacties om glucose-, leverenzym- en bilirubinewaarden te rapporteren.

Voedsel en dranken. De kleur van bier wordt volgens de methode van de European Brewery Convention (EBC) gemeten via de absorbantie bij 430 nm. Vergelijkbare methoden worden gebruikt om de kleur van wijn en frisdrank te controleren.

Beperkingen van de wet van Beer-Lambert

De wet gaat ervan uit dat het licht één enkele, nauwkeurige golflengte heeft en dat het monster geen licht verstrooit. In enkele veelvoorkomende situaties gaat de wet niet meer op:

• Hoge concentratie. Boven ongeveer 0,01 mol/L gaan opgeloste moleculen met elkaar reageren en neemt de absorbantie niet langer lineair toe met de concentratie.
• Troebele of deeltjesbevattende monsters. Suspensies en troebele vloeistoffen verstrooien licht naast het absorberen ervan, waardoor de gemeten absorbantie te hoog uitvalt. De wet van Beer-Lambert houdt geen rekening met verstrooiing; voor ondoorzichtige of lichtverstrooiende monsters, zoals poeders, wordt een verwant model gebruikt: de theorie van Kubelka-Munk.
• Chemische veranderingen tijdens de meting. Sommige stoffen vallen onder invloed van licht uiteen of veranderen tijdens de meting door een verschuiving van de pH, waardoor de afgelezen waarde halverwege verandert.
• Temperatuursveranderingen. De molaire absorptiviteit hangt af van de temperatuur, waardoor metingen bij niet-overeenkomende temperaturen niet rechtstreeks vergelijkbaar zijn.

Geschiedenis

De wet ontwikkelde zich gedurende meer dan een eeuw door het werk van drie wetenschappers. Pierre Bouguer beschreef in 1729 dat elke gelijke laag van een materiaal een gelijke fractie absorbeert van het licht dat erdoorheen gaat. Johann Heinrich Lambert formuleerde dit verband wiskundig opnieuw in zijn boek Photometria uit 1760 en toonde aan dat de absorbantie recht evenredig toeneemt met de optische weglengte. August Beer breidde de wet in 1852 uit en toonde aan dat de absorbantie ook recht evenredig toeneemt met de concentratie. De gecombineerde wet wordt soms de wet van Bouguer-Beer-Lambert genoemd, als erkenning voor alle drie.

Veelgestelde vragen

Waarvoor wordt de wet van Beer-Lambert gebruikt? De wet berekent hoeveel licht een oplossing absorbeert en kan omgekeerd worden gebruikt om uit een gemeten absorbantie een onbekende concentratie te bepalen. Daarmee vormt de wet de basis van UV-Vis-spectrofotometrie, een veelgebruikte laboratoriumtechniek om de hoeveelheid van een stof in een oplossing te meten.

Welke eenheden gebruikt de wet van Beer-Lambert? De optische weglengte wordt uitgedrukt in centimeter, de molaire absorptiviteit in L/(mol·cm) en de concentratie in mol/L. Absorbantie heeft zelf geen eenheid, hoewel deze soms wordt aangeduid als "AU" voor absorbantie-eenheden. Het gebruik van andere eenheden in de formule zonder ze eerst om te rekenen leidt tot een onjuist antwoord.

Waarom is mijn absorbantiemeting niet evenredig met de concentratie? De meest voorkomende oorzaken zijn een concentratie boven ongeveer 0,01 mol/L, een troebel of deeltjesbevattend monster, of een meting die ver buiten het bereik 0,3–0,9 ligt waarin instrumenten het nauwkeurigst zijn. Het monster verdunnen en opnieuw meten maakt meestal duidelijk welke oorzaak van toepassing is.

Wat is het verschil tussen absorbantie en transmissie? Transmissie is de fractie van het licht die door een monster heen gaat. Absorbantie is de negatieve logaritme met grondtal 10 van de transmissie: A = −log₁₀(T). Naarmate de absorbantie toeneemt, neemt de transmissie af.

Wat is het verschil tussen absorbantie en optische dichtheid? Het gaat om dezelfde grootheid. "Optische dichtheid" is de term die vaker in de biologie wordt gebruikt, terwijl "absorbantie" gebruikelijker is in de chemie.

Welk absorbantiebereik is het nauwkeurigst? Ongeveer 0,3 tot 0,9. Onder dit bereik overheerst instrumentruis het signaal. Boven ongeveer 1,5 veroorzaakt strooilicht in het instrument fouten en boven ongeveer 2,5 kunnen de meeste instrumenten helemaal geen betrouwbare meting meer geven.

Referenties

1. Beer, A. (1852). "Bestimmung der Absorption des rothen Lichts in farbigen Flüssigkeiten." Annalen der Physik und Chemie, 86: 78–88.
2. Swinehart, D. F. (1962). "The Beer-Lambert Law." Journal of Chemical Education, 39(7): 333–335.
3. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., & Popp, J. (2020). "The Bouguer-Beer-Lambert Law: Shining Light on the Obscure." ChemPhysChem, 21(18): 2029–2046.