Калькулятор закона Бугера-Ламберта - Мгновенный расчет поглощения

Что такое закон Бугера—Ламберта—Бера?

Закон Бугера—Ламберта—Бера — это формула, описывающая, какое количество света поглощает раствор. Она связывает оптическую плотность с тремя величинами: концентрацией раствора, интенсивностью поглощения света растворённым веществом и расстоянием, которое свет проходит через образец. Его также называют законом Бера. Калькулятор по закону Бугера—Ламберта—Бера применяет эту формулу, чтобы по нескольким простым исходным данным определить оптическую плотность, коэффициент пропускания и процент поглощённого света.

Закон — один из основных инструментов спектроскопии, науки о поглощении и испускании света веществом. Его ежедневно используют в химических, биологических и медицинских лабораториях для измерения концентрации веществ в растворе.

Формула закона Бугера—Ламберта—Бера

Закон Бугера—Ламберта—Бера гласит:

$A = \varepsilon \times c \times l$

• A — оптическая плотность, то есть количество света, поглощаемого раствором при заданной длине волны. Единиц измерения нет.
• ε (эпсилон) — молярный коэффициент поглощения, также называемый молярным коэффициентом экстинкции. Она показывает, насколько сильно вещество поглощает свет при определённой длине волны. Единицы измерения: л/(моль·см).
• c — концентрация вещества, выраженная в моль/л (молярность).
• l — длина оптического пути, то есть расстояние, которое свет проходит через образец, в см.

Оптическая плотность связана с коэффициентом пропускания — долей света, проходящей через образец:

$A = -\log_{10}(T)$

$T = 10^{-A}$

Здесь T — коэффициент пропускания, число от 0 до 1. Умножение T на 100 даёт процент пропущенного света. Процент поглощённого света равен:

$\text{Процент поглощённого света} = (1 - T) \times 100\%$

Например, оптическая плотность 1,0 означает, что T = 0,1, поэтому было поглощено 90 % света. Оптическая плотность 2,0 означает, что T = 0,01, поэтому было поглощено 99 % света.

Как рассчитать оптическую плотность

Чтобы найти оптическую плотность с помощью калькулятора, введите три значения:

1. Длина оптического пути (l) — ширина ёмкости для образца, обычно кюветы. Ширина большинства стандартных кювет составляет 1 см, однако у некоторых специализированных кювет она равна 0,1 см или 10 см.
2. Молярная поглощательная способность (ε) — свойство конкретного вещества при определённой длине волны. Обычно её находят в опубликованных справочных таблицах или рассчитывают по структуре молекулы. Например, белки поглощают свет в области 280 нм из-за двух аминокислот — триптофана и тирозина, а точное значение зависит от количества этих аминокислот в белке.
3. Концентрация (c) — количество растворённого вещества в моль/л. Концентрации, заданные в других единицах, например в мг/мл, сначала необходимо перевести с использованием молярной массы молекулы.

Калькулятор перемножает три числа и получает оптическую плотность, затем по этому результату рассчитывает коэффициент пропускания и процент поглощённого света.

Пример расчёта

Исследователь очищает белок и должен проверить его концентрацию перед проведением эксперимента. Молярный коэффициент поглощения белка при 280 нм известен из его аминокислотной последовательности: ε = 44 000 л/(mol·cm). Исследователь измеряет образец в стандартной кювете размером 1 см и получает оптическую плотность A = 0,523.

Преобразуем формулу, чтобы выразить концентрацию:

$c = \frac{A}{\varepsilon \times l} = \frac{0.523}{44{,}000 \times 1} = 1.19 \times 10^{-5} \text{ моль/л}$

Это 11,9 микромоля (мкМ). Значение находится в диапазоне, в котором приборы дают наиболее точные показания, поэтому исследователь может доверять результату и не разбавлять образец дополнительно.

Интерпретация значений оптической плотности

• A = 0: свет на этой длине волны не поглощается.
• A = 0,3 до 0,9: диапазон, в котором большинство спектрофотометров даёт наиболее точные линейные показания.
• A = 1,0: поглощается 90 % света, пропускается 10 %.
• A = 2,0: поглощается 99 % света, пропускается 1 %.
• A выше 2,5: значение выходит за пределы надёжного диапазона большинства приборов. Образец следует разбавить и измерить повторно.

На показания ниже примерно 0,3 влияет шум прибора. На показания выше примерно 1,5 влияют небольшие количества рассеянного света внутри прибора, что приводит к ошибке. Если показание выходит за пределы точного диапазона, стандартное решение — разбавить образец и измерить его повторно.

Где применяется закон Бугера—Ламберта—Бера

Аналитическая химия. Лаборатории измеряют оптическую плотность образца и с помощью формулы рассчитывают неизвестную концентрацию. Это распространено при определении содержания нитратов, фосфатов и ионов металлов в воде, а также при проверке концентрации химической партии в процессе производства.

Биохимия. Оптическая плотность при 280 нм позволяет оценить концентрацию белка. Оптическая плотность при 260 нм позволяет оценить концентрацию ДНК или РНК; согласно принятому соглашению, оптическая плотность 1,0 соответствует примерно 50 μg/мл двуцепочечной ДНК или 40 μg/мл РНК. Соотношение двух показаний (A260/A280) даёт приблизительную оценку чистоты образца.

Фармацевтика. Производители лекарств используют показания оптической плотности, чтобы проверять, как быстро таблетка высвобождает действующее вещество, и отслеживать разрушение препарата при хранении.

Медицина. Многие автоматические анализаторы крови измеряют оптическую плотность в ходе цветных химических реакций, чтобы определить содержание глюкозы, печёночных ферментов и билирубина.

Пища и напитки. Цвет пива измеряют по оптической плотности при 430 нм в соответствии с методом Европейской пивоваренной конвенции (EBC). Аналогичные методы применяют для оценки цвета вина и безалкогольных напитков.

Ограничения закона Бугера—Ламберта—Бера

Закон предполагает, что свет имеет одну точно заданную длину волны, а образец не рассеивает свет. В нескольких распространённых ситуациях он перестаёт работать:

• Высокая концентрация. При концентрации выше примерно 0,01 mol/л растворённые молекулы начинают взаимодействовать друг с другом, и оптическая плотность перестаёт линейно возрастать с концентрацией.
• Мутные образцы или образцы с частицами. Суспензии и мутные жидкости не только поглощают, но и рассеивают свет, из-за чего показание оптической плотности завышается. Закон Бугера—Ламберта—Бера не учитывает рассеяние; для непрозрачных или рассеивающих образцов, например порошков, применяют связанную с ним теорию Кубелки—Мунка.
• Химические изменения во время измерения. Некоторые вещества разрушаются под действием света или изменяются при изменении pH во время измерения, из-за чего показание меняется в процессе.
• Изменения температуры. Молярная поглощательная способность зависит от температуры, поэтому показания, полученные при разных температурах, нельзя напрямую сравнивать.

История

Закон формировался более века благодаря работам трёх учёных. В 1729 Пьер Бугер описал, что каждый слой материала одинаковой толщины поглощает одинаковую долю проходящего через него света. Иоганн Генрих Ламберт математически сформулировал эту зависимость в своей книге Photometria, опубликованной в 1760, показав, что оптическая плотность прямо пропорциональна длине оптического пути. Август Бер в 1852 расширил закон, показав, что оптическая плотность также прямо пропорциональна концентрации. Объединённый закон иногда называют законом Бугера—Бера—Ламберта в честь всех трёх учёных.

Часто задаваемые вопросы

Для чего используется закон Бугера—Ламберта—Бера? Он рассчитывает, какое количество света поглощает раствор, а также позволяет в обратном порядке определить неизвестную концентрацию по измеренной оптической плотности. Поэтому он лежит в основе УФ-видимой спектрофотометрии — распространённого лабораторного метода измерения количества вещества в растворе.

Какие единицы используются в законе Бугера—Ламберта—Бера? Длина оптического пути выражается в сантиметрах, молярный коэффициент поглощения — в л/(моль·см), а концентрация — в моль/л. Сама оптическая плотность единиц не имеет, хотя иногда для неё используют обозначение «AU» (единицы оптической плотности). Подстановка в формулу других единиц без предварительного перевода приводит к неправильному результату.

Почему моё показание оптической плотности не пропорционально концентрации? Наиболее распространённые причины — концентрация выше примерно 0,01 mol/л, мутный образец или образец с частицами либо показание, значительно выходящее за пределы диапазона 0,3–0,9, в котором приборы наиболее точны. Разбавление образца и повторное измерение обычно помогают определить причину.

В чём разница между оптической плотностью и коэффициентом пропускания? Коэффициент пропускания — это доля света, проходящего через образец. Оптическая плотность — отрицательный логарифм коэффициента пропускания по основанию 10: A = −log₁₀(T). При увеличении оптической плотности коэффициент пропускания уменьшается.

В чём разница между оптической плотностью и абсорбцией? Это одна и та же величина. Термин «оптическая плотность» чаще используют в биологии, а «абсорбция» — в химии.

Какой диапазон оптической плотности наиболее точен? Примерно от 0,3 до 0,9. Ниже этого диапазона сигнал в основном определяется шумом прибора. Выше примерно 1,5 рассеянный свет внутри прибора вносит ошибку, а выше примерно 2,5 большинство приборов уже не может дать надёжное показание.

Источники

1. Beer, A. (1852). «Bestimmung der Absorption des rothen Lichts in farbigen Flüssigkeiten». Annalen der Physik und Chemie, 86: 78–88.
2. Swinehart, D. F. (1962). «The Beer-Lambert Law». Journal of Chemical Education, 39(7): 333–335.
3. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., & Popp, J. (2020). «The Bouguer-Beer-Lambert Law: Shining Light on the Obscure». ChemPhysChem, 21(18): 2029–2046.