Калькулятор температуры отжига ДНК | Бесплатный инструмент для ПЦР

Что такое калькулятор температуры отжига ДНК?

Калькулятор температуры отжига ДНК оценивает температуру плавления (Tm) праймера ДНК по его последовательности. Tm — это температура, при которой половина молекул праймера связана с целевой цепью, а половина — нет. В полимеразной цепной реакции (ПЦР) это значение помогает определить температуру, используемую для присоединения праймеров к матрице ДНК.

Почему температура отжига важна в ПЦР

ПЦР копирует целевой фрагмент ДНК посредством повторяющихся циклов нагревания и охлаждения. Каждый цикл состоит из трёх этапов. Сначала нагревание примерно до 95 °C разделяет двуцепочечную матрицу. Этот этап называется денатурацией. Затем реакционную смесь охлаждают до температуры отжига, обычно от 50 °C до 65 °C, чтобы короткие праймеры могли связаться с комплементарными последовательностями одноцепочечной ДНК. На третьем этапе температура повышается примерно до 72 °C, и фермент, называемый ДНК-полимеразой, удлиняет праймеры, создавая новые цепи ДНК.

Если температура отжига слишком низкая, праймеры связываются с последовательностями, совпадающими лишь частично, что приводит к образованию дополнительных нежелательных фрагментов ДНК. Если она слишком высокая, праймеры не могут образовать устойчивую связь с матрицей, и ДНК копируется в малом количестве или не копируется вовсе. Температура отжига — один из первых параметров, которые исследователи изменяют при неудаче ПЦР.

Как содержание GC влияет на Tm

Праймер соединяется с целевой последовательностью посредством водородных связей. Пара гуанин—цитозин (G-C) образует три водородные связи. Пара аденин—тимин (A-T) образует две. Для разделения праймера с большим количеством оснований G и C требуется больше тепла, поэтому его Tm выше, чем у праймера такой же длины с большим количеством оснований A и T. Содержание GC обычно записывают в процентах: количество оснований G и C делят на общую длину последовательности и умножают на 100.

Формула температуры отжига ДНК

Этот калькулятор применяет одну из двух формул в зависимости от длины праймера.

Для праймеров длиной 14 нуклеотидов и более используется формула Мармура—Доти для расчёта GC-содержания:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Здесь N_GC — число оснований G и C в праймере, подсчитанное непосредственно, а не выраженное в процентах. N — общее число оснований.

Для праймеров короче 14 нуклеотидов используется правило Уоллеса:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G и C обозначают количество соответствующего основания в праймере.

Обе формулы предполагают стандартные условия ПЦР: концентрацию праймера около 50 нМ и Na+ около 50 мМ.

Разобранный пример

Рассмотрим праймер длиной 19 оснований ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Его длина равна 19, то есть 14 или больше, поэтому калькулятор использует формулу Мармура—Доти.

• Длина (N) = 19
• Количество G = 5, количество C = 5, поэтому N_GC = 10, а содержание GC составляет 10 / 19 × 100 ≈ 52,6 %
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

В формуле используется количество оснований GC, 10, а не процентное содержание GC, 52,6. Если по ошибке использовать процентное значение, получится Tm около 143 °C, что нереалистично для ПЦР, проводимой при температуре от 50 °C до 95 °C.

Как пользоваться этим калькулятором

Введите или вставьте последовательность праймера, используя только буквы A, T, G и C. Калькулятор показывает длину последовательности в нуклеотидах (nt), содержание GC в процентах и рассчитанную температуру отжига в градусах Цельсия. Результат можно скопировать в лабораторные записи или протокол.

Выбор температуры отжига для ПЦР

Tm — это расчётная оценка, а не гарантированная рабочая температура. Во многих протоколах фактический этап отжига начинают на несколько градусов ниже рассчитанной Tm, а затем корректируют температуру по результату электрофореза в геле. Для пары праймеров в качестве начальной обычно используют меньшее из двух значений Tm. Градиентная ПЦР, при которой одновременно проводят несколько реакций в диапазоне температур, — распространённый способ найти оптимальную температуру экспериментальным путём.

Другие способы оценки Tm

Используемые здесь формулы Мармура—Доти и Уоллеса дают быстрые приближённые оценки, основанные только на составе оснований. Существуют и другие методы:

• Термодинамика ближайших соседей учитывает влияние каждой пары соседних оснований на стабильность и считается более точным методом для стандартных праймеров.
• Формулы с поправкой на соли учитывают концентрацию ионов Na+ или K+ в реакционном буфере, поскольку более высокая концентрация соли стабилизирует дуплекс ДНК и повышает Tm.

Разные калькуляторы могут выдавать разные значения Tm для одного и того же праймера, поскольку используют разные формулы. Окончательной проверкой остаётся проведение ПЦР и оценка результата.

Часто задаваемые вопросы

Что такое температура отжига ДНК?

Это температура, при которой праймеры ДНК связываются с комплементарной последовательностью на матричной цепи во время ПЦР. В лабораториях её обычно устанавливают на несколько градусов ниже расчётной температуры плавления (Tm) праймера.

Как рассчитывается Tm праймера?

Для праймеров длиной 14 оснований и более Tm = 64,9 + 41 × (количество GC − 16,4) / длина. Для праймеров короче 14 оснований Tm = 2 × (количество A+T) + 4 × (количество G+C).

Почему содержание GC повышает Tm?

Пары оснований G-C образуют три водородные связи, тогда как пары оснований A-T — две водородные связи. Для отделения праймера с большей долей оснований G и C от целевой последовательности требуется больше энергии и, следовательно, более высокая температура.

Должна ли температура отжига ПЦР равняться расчётной Tm?

Нет. В большинстве протоколов начинают с температуры на несколько градусов ниже расчётной Tm и затем корректируют её, поскольку Tm соответствует точке, в которой связана только половина праймера.

Влияет ли длина праймера на Tm?

Да, хотя зависимость не является простой. Длина находится в знаменателе формулы Мармура—Доти, поэтому более длинный праймер со средним содержанием GC не обязательно имеет более высокую Tm, чем более короткий праймер с высоким содержанием GC.

Почему разные калькуляторы Tm дают разные результаты?

Они используют разные формулы. Правило Уоллеса, формула содержания GC Мармура—Доти, термодинамика ближайших соседей и формулы с поправкой на соли могут давать разные значения Tm для одного и того же праймера, иногда отличающиеся на несколько градусов.

Источники

1. Marmur J, Doty P. Определение состава оснований дезоксирибонуклеиновой кислоты по температуре её термической денатурации. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Гибридизация синтетических олигодезоксирибонуклеотидов с ДНК phi chi 174. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. Унифицированный взгляд на термодинамику ближайших соседей полимерной, двухцепочечной и олигонуклеотидной ДНК. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.