Калькулятор копий ДНК | Инструмент геномного анализа

Калькулятор числа копий ДНК

Калькулятор числа копий ДНК оценивает, сколько копий целевой последовательности содержится в образце ДНК. Для этого используются концентрация и объём образца, а также частота встречаемости целевой последовательности внутри более длинной последовательности ДНК. Лаборатории молекулярной биологии применяют такую оценку для планирования экспериментов, например количественной полимеразной цепной реакции (qPCR), до проведения более дорогого и точного анализа.

Что означает число копий ДНК

Число копий ДНК — это количество повторений определённой последовательности в геноме или образце. Типичный ген человека представлен двумя копиями: по одной, унаследованной от каждого родителя. Это число может изменяться по нескольким причинам.

• Амплификация: более двух копий. В раковых клетках часто амплифицируются гены, стимулирующие рост, например HER2 в некоторых опухолях молочной железы.
• Делеция: менее двух копий, иногда ни одной. Делеции могут вызывать генетические заболевания.
• Дупликация: появляется дополнительная копия там, где должна быть одна или две.
• Вариация числа копий (CNV): нормальное различие числа копий у разных людей, встречающееся в значительной части генома человека.

Формула для расчёта числа копий ДНК

Калькулятор преобразует количество вхождений последовательности и массу образца в число копий по следующей формуле:

$\text{Число копий} = \frac{\text{Число вхождений} \times \text{Концентрация} \times \text{Объём} \times N_A}{\text{Длина ДНК} \times 660 \times 10^{9}}$

Где:

• Число вхождений — количество появлений целевой последовательности в полной последовательности ДНК; перекрывающиеся совпадения подсчитываются отдельно.
• Концентрация — концентрация ДНК в нанограммах на микролитр (нг/мкл), обычно измеряемая с помощью спектрофотометра или флуориметра.
• Объём — объём образца в микролитрах (мкл).
• $N_A$ — число Авогадро: 6,022 × 10²³ молекул на моль. Оно преобразует количество вещества ДНК в число молекул.
• Длина ДНК — длина полной последовательности ДНК в парах оснований.
• 660 — средняя молекулярная масса одной пары оснований ДНК в граммах на моль (г/моль). Пара оснований состоит из двух комплементарных нуклеотидов, по одному из каждой цепи ДНК.
• 10⁹ — коэффициент перевода нанограммов в граммы.

Сначала формула переводит массу образца в число молей молекул ДНК, затем умножает его на число Авогадро, чтобы получить общее число молекул ДНК в образце, и после этого — на количество вхождений целевой последовательности в каждой молекуле.

Инструмент принимает только буквы A, T, C и G. Пробелы и разрывы строк игнорируются, а строчные буквы считаются такими же, как прописные.

Как рассчитать число копий ДНК: пример с пошаговым решением

Рассмотрим последовательность ДНК длиной 12 пар оснований — ATCGATCGATCG — с целевой последовательностью ATCG, концентрацией 10 нг/мкл и объёмом 20 мкл.

Шаг 1: подсчёт вхождений. ATCG встречается 3 раза в ATCGATCGATCG — в позициях 1, 5 и 9.

Шаг 2: определение общей массы ДНК. Концентрация × объём = 10 × 20 = 200 нг.

Шаг 3: перевод в количество вещества. 200 нг = 2 × 10⁻⁷ г. Делим на (12 пар оснований × 660 г/моль) = 7 920 г/моль. Получается 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Шаг 4: перевод в число молекул. Умножаем на число Авогадро: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ молекул/моль ≈ 1,52 × 10¹³ молекул ДНК.

Шаг 5: умножение на число вхождений. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, то есть примерно 45 621 212 121 212 копий.

Это число кажется огромным, поскольку образец объёмом 20 мкл и концентрацией 10 нг/мкл всё ещё содержит триллионы коротких молекул ДНК. В реальных образцах обычно используются гораздо более длинные последовательности, поэтому при той же массе число молекул меньше.

Где применяется анализ числа копий ДНК

Диагностика рака. Патологические лаборатории проверяют число копий HER2 в ткани опухоли молочной железы. Нормальная клетка содержит две копии. В амплифицированной опухоли их может быть шесть или больше, что влияет на возможность назначения таргетных препаратов, таких как трастузумаб.

Тестирование на генетические заболевания. Такие состояния, как синдром Ди Джорджи, связаны с делецией участка хромосомы. При синдроме Дауна присутствует дополнительная копия хромосомы 21 — трисомия 21. Подсчёт копий помогает подтвердить эти диагнозы.

Количественная оценка трансгенов и плазмид. Исследователи проверяют, сколько копий встроенного гена попало в клетку растения, животного или бактерии. Обычно предпочтительна одна копия, поскольку несколько копий могут запустить подавление экспрессии гена клеткой.

Мониторинг патогенов и вирусной нагрузки. Оценка числа копий показывает, сколько вирусной или бактериальной ДНК присутствует в образце; этот показатель используется при мониторинге инфекций и экологическом тестировании.

Другие методы измерения числа копий

Этот калькулятор быстро оценивает число копий по данным о последовательности и концентрации. Лаборатории, которым нужна более высокая точность, обычно используют один из следующих методов:

• Количественная ПЦР (qPCR): амплифицирует ДНК и измеряет её в реальном времени; при хорошей калибровочной кривой точность составляет примерно 15–20%.
• Цифровая ПЦР (dPCR): разделяет образец на тысячи небольших реакций для прямого подсчёта без калибровочной кривой.
• Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH): непосредственно подсчитывает последовательности под микроскопом в клетках или хромосомах; это стандартный метод во многих лабораториях диагностики рака.
• Секвенирование нового поколения (NGS): секвенирует весь образец и одновременно определяет число копий по всему геному.

Часто задаваемые вопросы

Что такое число копий ДНК? Это количество появлений данной последовательности ДНК в геноме или образце. Большинство генов человека представлены двумя копиями — по одной от каждого родителя. Дополнительные или отсутствующие копии могут влиять на здоровье и риск заболеваний.

Насколько точен этот калькулятор? Он даёт теоретическую оценку на основе введённых данных, а не результат лабораторного измерения. Точность зависит от того, насколько точно измерена концентрация и насколько специфична целевая последовательность. Для получения результатов, представляемых в публикациях, используют более точные методы, например цифровую ПЦР.

Можно ли использовать этот калькулятор для РНК? Нет. В РНК вместо тимина используется урацил, а сахар в её составе другой, поэтому её молекулярная масса отличается от массы ДНК. Средняя молекулярная масса РНК составляет около 330 г/моль на нуклеотид, тогда как для пары оснований ДНК она составляет около 660 г/моль. Применение формулы для ДНК к данным РНК даст неправильный результат.

Почему перекрывающаяся последовательность подсчитывается более одного раза? Калькулятор подсчитывает каждую позицию, в которой целевая последовательность совпадает, даже если совпадения используют общие буквы. В ATATAT последовательность ATA совпадает дважды — в позиции 1 и в позиции 3, поскольку каждая начальная позиция проверяется отдельно.

Какой диапазон концентраций ДНК оптимален? Диапазон концентраций 10–100 нг/мкл даёт наиболее надёжные показания на стандартных лабораторных приборах. Ниже 10 нг/мкл погрешность измерения возрастает, поэтому вместо стандартного спектрофотометра рекомендуется более чувствительный метод, например флуориметрия.

Может ли этот калькулятор оценить число копий плазмиды? Да. Введите полную последовательность плазмиды как последовательность ДНК, а уникальный участок вставки — как целевую последовательность, а также измеренные концентрацию плазмиды и объём образца.