Kalkulačka Beerovho-Lambertovho zákona - Okamžitý výpočet absorbancie

Čo je Beerov-Lambertov zákon?

Beerov-Lambertov zákon je vzorec, ktorý opisuje, koľko svetla roztok absorbuje. Absorbanciu spája s tromi faktormi: koncentráciou roztoku, intenzitou absorpcie svetla rozpustenou látkou a dĺžkou dráhy, ktorú svetlo prejde vzorkou. Nazýva sa aj Beerov zákon. Kalkulačka Beerovho-Lambertovho zákona používa tento vzorec na výpočet absorbancie, transmitancie a percenta absorbovaného svetla z niekoľkých jednoduchých vstupných údajov.

Zákon je základným nástrojom v spektroskopii, pri štúdiu toho, ako látky absorbujú a vyžarujú svetlo. Každodenne sa používa v chemických, biologických a medicínskych laboratóriách na meranie koncentrácie látok v roztoku.

Vzorec Beerovho-Lambertovho zákona

Beerov-Lambertov zákon hovorí:

$A = \varepsilon \times c \times l$

• A je absorbancia, teda množstvo svetla, ktoré roztok absorbuje pri danej vlnovej dĺžke. Nemá jednotku.
• ε (epsilon) je molárna absorptivita, nazývaná aj molárny extinkčný koeficient. Udáva, ako silno látka absorbuje svetlo pri konkrétnej vlnovej dĺžke. Jednotka: L/(mol·cm).
• c je koncentrácia látky v mol/L (molarita).
• l je optická dráha, teda vzdialenosť, ktorú svetlo prejde vzorkou, v cm.

Absorbancia súvisí s transmitanciou, teda podielom svetla, ktoré prejde vzorkou:

$A = -\log_{10}(T)$

$T = 10^{-A}$

T je transmitancia, číslo medzi 0 a 1. Vynásobením T hodnotou 100 získame percento prepusteného svetla. Percento absorbovaného svetla je:

$\text{Percento absorbovaného svetla} = (1 - T) \times 100\%$

Napríklad absorbancia 1,0 znamená T = 0,1, takže sa absorbovalo 90 % svetla. Absorbancia 2,0 znamená T = 0,01, takže sa absorbovalo 99 % svetla.

Ako vypočítať absorbanciu

Ak chcete pomocou kalkulačky zistiť absorbanciu, zadajte tri hodnoty:

1. Dĺžka optickej dráhy (l) — šírka nádoby so vzorkou, zvyčajne kyvety. Väčšina štandardných kyviet má šírku 1 cm, hoci niektoré špecializované kyvety majú šírku 0,1 cm alebo 10 cm.
2. Molárna absorptivita (ε) — vlastnosť konkrétnej látky pri konkrétnej vlnovej dĺžke. Zvyčajne sa uvádza v publikovaných referenčných tabuľkách alebo sa vypočítava zo štruktúry molekuly. Napríklad bielkoviny absorbujú svetlo približne pri 280 nm v dôsledku prítomnosti dvoch aminokyselín, tryptofánu a tyrozínu, pričom presná hodnota závisí od ich počtu v bielkovine.
3. Koncentrácia (c) — množstvo rozpustenej látky v mol/L. Koncentrácie uvedené v iných jednotkách, napríklad v mg/mL, treba najskôr prepočítať pomocou molárnej hmotnosti molekuly.

Kalkulačka vynásobí tieto tri čísla a získa absorbanciu, potom z tejto hodnoty odvodí transmitanciu a percento absorbovaného svetla.

Vzorový príklad

Výskumník čistí bielkovinu a pred vykonaním experimentu potrebuje skontrolovať jej koncentráciu. Molárna absorptivita bielkoviny pri 280 nm je známa z jej sekvencie: ε = 44 000 L/(mol·cm). Výskumník zmeria vzorku v štandardnej kyvete s optickou dráhou 1 cm a nameria absorbanciu A = 0,523.

Úpravou vzorca na výpočet koncentrácie:

$c = \frac{A}{\varepsilon \times l} = \frac{0.523}{44{,}000 \times 1} = 1.19 \times 10^{-5} \text{ mol/L}$

To je 11,9 mikromólu (μM). Táto hodnota spadá do rozsahu, v ktorom prístroje merajú najpresnejšie, takže výskumník môže výsledku dôverovať bez ďalšieho riedenia vzorky.

Interpretácia hodnôt absorbancie

• A = 0: pri tejto vlnovej dĺžke sa neabsorbuje žiadne svetlo.
• A = 0,3 až 0,9: rozsah, v ktorom väčšina spektrofotometrov poskytuje najpresnejšie a lineárne merania.
• A = 1,0: absorbovalo sa 90 % svetla a 10 % prešlo vzorkou.
• A = 2,0: absorbovalo sa 99 % svetla a 1 % prešlo vzorkou.
• A vyššia než 2,5: hodnota je mimo spoľahlivého rozsahu väčšiny prístrojov. Vzorku treba zriediť a meranie zopakovať.

Merania nižšie než približne 0,3 ovplyvňuje šum prístroja. Merania vyššie než približne 1,5 ovplyvňuje malé množstvo parazitného svetla vo vnútri prístroja, ktoré spôsobuje chybu. Keď meranie spadá mimo presného rozsahu, štandardným riešením je vzorku zriediť a zmerať znova.

Kde sa Beerov-Lambertov zákon používa

Analytická chémia. Laboratóriá zmerajú absorbanciu vzorky a pomocou vzorca spätne vypočítajú neznámu koncentráciu. Tento postup sa bežne používa pri stanovovaní obsahu dusičnanov, fosforečnanov a iónov kovov vo vode, ako aj pri kontrole koncentrácie chemickej šarže počas výroby.

Biochémia. Absorbancia pri 280 nm odhaduje koncentráciu bielkovín. Absorbancia pri 260 nm odhaduje koncentráciu DNA alebo RNA; podľa zaužívanej konvencie absorbancia 1,0 zodpovedá približne 50 μg/mL dvojvláknovej DNA alebo 40 μg/mL RNA. Pomer týchto dvoch meraní (A260/A280) poskytuje približný údaj o čistote vzorky.

Farmaceutický priemysel. Výrobcovia liekov používajú merania absorbancie na testovanie rýchlosti uvoľňovania účinnej látky z tablety a na sledovanie degradácie lieku počas skladovania.

Medicína. Mnohé automatizované prístroje na analýzu krvi merajú absorbanciu pri chemických reakciách, ktoré menia farbu, a určujú tak hladiny glukózy, pečeňových enzýmov a bilirubínu.

Potraviny a nápoje. Farba piva sa meria absorbanciou pri 430 nm podľa metódy Európskeho pivovarníckeho dohovoru (EBC). Podobné metódy sa používajú na kontrolu farby vína a nealkoholických nápojov.

Obmedzenia Beerovho-Lambertovho zákona

Zákon predpokladá, že svetlo má jednu presne určenú vlnovú dĺžku a že vzorka svetlo nerozptyľuje. V niekoľkých bežných situáciách prestáva platiť:

• Vysoká koncentrácia. Pri koncentrácii vyššej než približne 0,01 mol/L začnú rozpustené molekuly navzájom interagovať a absorbancia prestane rásť priamo úmerne koncentrácii.
• Zakalené vzorky alebo vzorky s časticami. Suspenzie a zakalené kvapaliny svetlo nielen absorbujú, ale aj rozptyľujú, čím nadhodnocujú nameranú absorbanciu. Beerov-Lambertov zákon rozptyl nezohľadňuje; pri nepriehľadných alebo rozptyľujúcich vzorkách, napríklad práškoch, sa používa súvisiaci model nazývaný Kubelka-Munkova teória.
• Chemické zmeny počas merania. Niektoré látky sa pôsobením svetla rozkladajú alebo sa počas merania menia v závislosti od pH, čo priebežne mení nameranú hodnotu.
• Zmeny teploty. Molárna absorptivita závisí od teploty, preto merania vykonané pri nezhodných teplotách nemožno priamo porovnávať.

História

Zákon vznikal viac než storočie vďaka práci troch vedcov. Pierre Bouguer v roku 1729 opísal, že každá rovnako hrubá vrstva materiálu absorbuje rovnaký podiel svetla, ktoré ňou prechádza. Johann Heinrich Lambert tento vzťah matematicky preformuloval vo svojej knihe Photometria z roku 1760 a ukázal, že absorbancia rastie priamo úmerne dĺžke optickej dráhy. August Beer v roku 1852 zákon rozšíril a ukázal, že absorbancia rastie priamo úmerne aj koncentrácii. Súhrnný zákon sa niekedy na počesť všetkých troch vedcov nazýva Bouguerovým-Beerovým-Lambertovým zákonom.

Často kladené otázky

Na čo sa používa Beerov-Lambertov zákon? Vypočítava, koľko svetla roztok absorbuje, a opačným postupom určuje neznámu koncentráciu z nameranej absorbancie. Preto tvorí základ UV-Vis spektrofotometrie, bežnej laboratórnej metódy na meranie množstva látky v roztoku.

Aké jednotky používa Beerov-Lambertov zákon? Dĺžka optickej dráhy sa uvádza v centimetroch, molárna absorptivita v L/(mol·cm) a koncentrácia v mol/L. Samotná absorbancia nemá jednotku, hoci sa niekedy označuje skratkou „AU“ (jednotky absorbancie). Použitie iných jednotiek vo vzorci bez ich predchádzajúceho prepočtu vedie k nesprávnemu výsledku.

Prečo moje meranie absorbancie nie je úmerné koncentrácii? Najčastejšími príčinami sú koncentrácia vyššia než približne 0,01 mol/L, zakalená vzorka alebo vzorka s časticami, prípadne meranie výrazne mimo rozsahu 0,3–0,9, v ktorom sú prístroje najpresnejšie. Zriedenie vzorky a opakované meranie zvyčajne ukáže, ktorá príčina sa uplatňuje.

Aký je rozdiel medzi absorbanciou a transmitanciou? Transmitancia je podiel svetla, ktoré prejde vzorkou. Absorbancia je záporný logaritmus so základom 10 transmitancie: A = −log₁₀(T). Keď absorbancia rastie, transmitancia klesá.

Aký je rozdiel medzi absorbanciou a optickou hustotou? Ide o tú istú veličinu. Pojem „optická hustota“ sa častejšie používa v biológii, zatiaľ čo „absorbancia“ je bežnejšia v chémii.

Aký rozsah absorbancie je najpresnejší? Približne 0,3 až 0,9. Pod touto hranicou v signáli prevláda šum prístroja. Nad približne 1,5 spôsobuje chybu parazitné svetlo vo vnútri prístroja a nad približne 2,5 väčšina prístrojov už nedokáže poskytnúť spoľahlivé meranie.

Zdroje

1. Beer, A. (1852). „Bestimmung der Absorption des rothen Lichts in farbigen Flüssigkeiten.“ Annalen der Physik und Chemie, 86: 78–88.
2. Swinehart, D. F. (1962). „The Beer-Lambert Law.“ Journal of Chemical Education, 39(7): 333–335.
3. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S. a Popp, J. (2020). „The Bouguer-Beer-Lambert Law: Shining Light on the Obscure.“ ChemPhysChem, 21(18): 2029–2046.