Kalkulačka počtu kópií DNA | Nástroj pre genomickú analýzu

Kalkulačka počtu kópií DNA

Kalkulačka počtu kópií DNA odhaduje, koľko kópií cieľovej sekvencie sa nachádza vo vzorke DNA. Vychádza z koncentrácie vzorky, jej objemu a frekvencie výskytu cieľovej sekvencie v rámci dlhšej sekvencie DNA. Laboratóriá molekulárnej biológie používajú takýto odhad na plánovanie experimentov, napríklad qPCR (kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia), ešte pred vykonaním nákladnejšej a presnejšej analýzy.

Čo znamená počet kópií DNA

Počet kópií DNA udáva, koľkokrát sa konkrétna sekvencia nachádza v genóme alebo vo vzorke. Typický ľudský gén sa nachádza v dvoch kópiách, pričom jednu zdedí človek od každého rodiča. Tento počet môže meniť viacero faktorov.

• Amplifikácia: viac než dve kópie. Nádorové bunky často amplifikujú gény podporujúce rast, napríklad HER2 v niektorých nádoroch prsníka.
• Delécia: menej než dve kópie, niekedy žiadna. Delécie môžu spôsobovať genetické poruchy.
• Duplikácia: objaví sa ďalšia kópia tam, kde by mala byť iba jedna alebo dve.
• Variácia počtu kópií (CNV): bežný rozdiel v počte kópií medzi jednotlivcami, ktorý sa vyskytuje vo významnej časti ľudského genómu.

Vzorec pre počet kópií DNA

Kalkulačka pomocou tohto vzorca prepočíta počet výskytov a hmotnosť vzorky na počet kópií:

$\text{Počet kópií} = \frac{\text{Počet výskytov} \times \text{Koncentrácia} \times \text{Objem} \times N_A}{\text{Dĺžka DNA} \times 660 \times 10^{9}}$

Kde:

• Počet výskytov — koľkokrát sa cieľová sekvencia nachádza v celej sekvencii DNA; prekrývajúce sa zhody sa počítajú samostatne.
• Koncentrácia — koncentrácia DNA v nanogramoch na mikroliter (ng/μL), zvyčajne stanovená spektrofotometrom alebo fluorometrom.
• Objem — objem vzorky v mikrolitroch (μL).
• $N_A$ — Avogadrova konštanta, 6,022 × 10²³ molekúl na mol. Prepočítava látkové množstvo DNA na počet molekúl.
• Dĺžka DNA — dĺžka celej sekvencie DNA v pároch báz.
• 660 — priemerná molekulová hmotnosť jedného páru báz DNA v gramoch na mol (g/mol). Pár báz tvoria dva spárované nukleotidy, po jednom z každého vlákna DNA.
• 10⁹ — prevádza nanogramy na gramy.

Vzorec najprv prepočíta hmotnosť vzorky na látkové množstvo molekúl DNA, vynásobí ho Avogadrovou konštantou, aby získal celkový počet molekúl DNA vo vzorke, a potom ho vynásobí počtom výskytov cieľovej sekvencie v každej molekule.

Nástroj prijíma iba písmená A, T, C a G. Medzery a zalomenia riadkov sa ignorujú a malé písmená sa počítajú rovnako ako veľké.

Ako vypočítať počet kópií DNA: riešený príklad

Uvažujme sekvenciu DNA s 12 pármi báz, ATCGATCGATCG, s cieľovou sekvenciou ATCG, koncentráciou 10 ng/μL a objemom 20 μL.

Krok 1: Spočítajte výskyty. Sekvencia ATCG sa v ATCGATCGATCG nachádza 3-krát (na pozíciách 1, 5 a 9).

Krok 2: Zistite celkovú hmotnosť DNA. Koncentrácia × objem = 10 × 20 = 200 ng.

Krok 3: Preveďte na látkové množstvo. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Vydeľte to súčinom (12 párov báz × 660 g/mol) = 7 920 g/mol. Výsledkom je 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Krok 4: Preveďte na počet molekúl. Vynásobte Avogadrovou konštantou: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ molekúl/mol ≈ 1,52 × 10¹³ molekúl DNA.

Krok 5: Vynásobte počtom výskytov. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, teda približne 45 621 212 121 212 kópií.

Toto číslo je veľmi vysoké, pretože vzorka s objemom 20 μL a koncentráciou 10 ng/μL stále obsahuje bilióny krátkych molekúl DNA. V skutočných vzorkách sa zvyčajne používajú oveľa dlhšie sekvencie, čo pri rovnakej hmotnosti znižuje počet molekúl.

Kde sa používa analýza počtu kópií DNA

Diagnostika nádorových ochorení. Patologické laboratóriá zisťujú počet kópií HER2 v tkanive nádoru prsníka. Normálna bunka obsahuje dve kópie. Amplifikovaný nádor ich môže obsahovať šesť alebo viac, čo ovplyvňuje vhodnosť liečby cielenými liekmi, ako je trastuzumab.

Testovanie genetických ochorení. Ochorenia, ako je DiGeorgeov syndróm, súvisia s deléciou časti chromozómu. Downov syndróm súvisí s ďalšou kópiou chromozómu 21 (trizómia 21). Počítanie kópií pomáha potvrdiť tieto diagnózy.

Kvantifikácia transgénov a plazmidov. Výskumníci zisťujú, koľko kópií vloženého génu sa dostalo do rastlinnej, živočíšnej alebo bakteriálnej bunky. Zvyčajne sa uprednostňuje jedna kópia, pretože viac kópií môže spustiť umlčanie génu bunkou.

Monitorovanie patogénov a vírusovej nálože. Odhady počtu kópií sledujú množstvo vírusovej alebo bakteriálnej DNA vo vzorke, čo sa využíva pri monitorovaní infekcií a environmentálnom testovaní.

Iné metódy merania počtu kópií

Táto kalkulačka poskytuje rýchly odhad zo sekvenčných údajov a údajov o koncentrácii. Laboratóriá, ktoré potrebujú väčšiu presnosť, zvyčajne používajú jednu z týchto metód:

• Kvantitatívna PCR (qPCR): amplifikuje a meria DNA v reálnom čase; pri dobrej kalibračnej krivke dosahuje presnosť približne 15–20%.
• Digitálna PCR (dPCR): rozdelí vzorku na tisíce drobných reakcií, ktoré umožňujú priame počítanie bez potreby kalibračnej krivky.
• Fluorescenčná in situ hybridizácia (FISH): priamo na bunkách alebo chromozómoch vizuálne počíta sekvencie pod mikroskopom; v mnohých laboratóriách nádorovej diagnostiky ide o štandardnú metódu.
• Sekvenovanie novej generácie (NGS): sekvenuje celú vzorku a naraz vytvára profil počtu kópií v celom genóme.

Často kladené otázky

Čo je počet kópií DNA? Je to počet výskytov určitej sekvencie DNA v genóme alebo vo vzorke. Väčšina ľudských génov sa nachádza v dvoch kópiách, po jednej od každého rodiča. Nadbytočné alebo chýbajúce kópie môžu ovplyvniť zdravie a riziko ochorenia.

Aká presná je táto kalkulačka? Poskytuje teoretický odhad založený na zadaných hodnotách, nie laboratórne meranie. Presnosť závisí od presnosti merania koncentrácie a od špecifickosti cieľovej sekvencie. Metódy ako digitálna PCR sú pri publikovaných výsledkoch presnejšie.

Dá sa táto kalkulačka použiť na RNA? Nie. RNA používa namiesto tymínu uracil a obsahuje iný cukor, takže jej molekulová hmotnosť sa líši od molekulovej hmotnosti DNA. RNA má priemernú molekulovú hmotnosť približne 330 g/mol na nukleotid v porovnaní s približne 660 g/mol na pár báz DNA. Použitie vzorca pre DNA na údaje o RNA by viedlo k nesprávnemu výsledku.

Prečo sa prekrývajúca sekvencia počíta viackrát? Kalkulačka počíta každú pozíciu, na ktorej sa cieľová sekvencia zhoduje, aj keď zhody zdieľajú niektoré písmená. V sekvencii ATATAT sa sekvencia ATA zhoduje dvakrát, na pozícii 1 a na pozícii 3, pretože každá začiatočná pozícia sa kontroluje samostatne.

Aký rozsah koncentrácie DNA je najvhodnejší? Koncentrácie 10–100 ng/μL poskytujú najspoľahlivejšie hodnoty pri použití bežných laboratórnych prístrojov. Pri koncentrácii nižšej než 10 ng/μL rastie chyba merania a namiesto bežného spektrofotometra sa odporúča citlivejšia metóda, napríklad fluorometer.

Dá sa touto kalkulačkou odhadnúť počet kópií plazmidu? Áno. Ako sekvenciu DNA zadajte celú sekvenciu plazmidu a ako cieľovú sekvenciu jedinečnú oblasť inzertu spolu s nameranou koncentráciou plazmidu a objemom vzorky.