Kalkulačka teploty anneálingu DNA | Bezplatný nástroj pre PCR Tm

Čo je kalkulačka hybridizačnej teploty DNA?

Kalkulačka hybridizačnej teploty DNA odhaduje teplotu topenia (Tm) DNA primeru na základe jeho sekvencie. Tm je teplota, pri ktorej je polovica molekúl primeru naviazaná na cieľové vlákno a polovica nie. V polymerázovej reťazovej reakcii (PCR) táto hodnota určuje teplotu používanú na naviazanie primerov na matricu DNA.

Prečo je nasedacia teplota dôležitá pri PCR

PCR kopíruje cieľový úsek DNA prostredníctvom opakovaných cyklov zahrievania a ochladzovania. Každý cyklus má tri kroky. Najprv sa dvojvláknový templát pri teplote približne 95 °C oddelí. Tento krok sa nazýva denaturácia. Potom sa reakcia ochladí na hybridizačnú teplotu, zvyčajne na hodnotu medzi 50 °C a 65 °C, aby sa krátke primery mohli naviazať na zodpovedajúce sekvencie na jednovláknových templátoch. Nakoniec teplota stúpne približne na 72 °C a enzým nazývaný DNA polymeráza predĺži primery a vytvorí nové vlákna DNA.

Ak je hybridizačná teplota príliš nízka, primery sa viažu na sekvencie, ktoré sa zhodujú iba čiastočne, a vznikajú ďalšie nežiaduce fragmenty DNA. Ak je príliš vysoká, primery nedokážu vytvoriť stabilnú väzbu s templátom a skopíruje sa málo DNA alebo sa neskopíruje žiadna. Hybridizačná teplota je jedným z prvých nastavení, ktoré výskumníci upravujú, keď PCR reakcia zlyhá.

Ako obsah GC ovplyvňuje Tm

Primer sa spája so svojím cieľom prostredníctvom vodíkových väzieb. Pár guanín-cytozín (G-C) vytvára tri vodíkové väzby. Pár adenín-tymín (A-T) vytvára dve. Primer s väčším počtom báz G a C potrebuje na oddelenie viac tepla, takže má vyššiu Tm než primer rovnakej dĺžky s väčším počtom báz A a T. Obsah GC sa zvyčajne uvádza v percentách: počet báz G a C vydelený celkovou dĺžkou sekvencie a vynásobený hodnotou 100.

Vzorec pre nasedaciu teplotu DNA

Táto kalkulačka používa jeden z dvoch vzorcov podľa dĺžky primeru.

Pri primeroch s dĺžkou 14 nukleotidov alebo viac používa Marmur-Dotyho vzorec pre obsah GC:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

N_GC je počet báz G a C v primeru, ktorý sa počíta priamo, nie ako percentuálna hodnota. N je celkový počet báz.

Pri primeroch kratších než 14 nukleotidov používa Wallaceovo pravidlo:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G a C označujú počet príslušných báz v primeru.

Oba vzorce predpokladajú bežné podmienky PCR: približne 50 nanomólov primeru a 50 milimólov Na+.

Vyriešený príklad

Uvažujme primer s 19 bázami ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Jeho dĺžka je 19, čo je 14 alebo viac, takže kalkulačka použije Marmurov-Dotyho vzorec.

• Dĺžka (N) = 19
• počet G = 5, počet C = 5, takže N_GC = 10 a obsah GC je 10 / 19 × 100 ≈ 52,6 %
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

Vzorec používa počet báz G a C, 10, nie percentuálny obsah GC, 52,6. Ak sa omylom použije percentuálna hodnota, Tm vyjde približne 143 °C, čo nie je realistická hodnota pre PCR reakciu prebiehajúcu medzi 50 °C a 95 °C.

Ako používať túto kalkulačku

Zadajte alebo vložte sekvenciu primeru, ktorá obsahuje iba písmená A, T, G a C. Kalkulačka zobrazí dĺžku sekvencie v nukleotidoch (nt), obsah GC v percentách a vypočítanú teplotu nasedania v stupňoch Celzia. Výsledok možno skopírovať do laboratórnych poznámok alebo protokolu.

Výber nasedacej teploty pri PCR

Tm je vypočítaný odhad, nie zaručená pracovná teplota. Mnohé protokoly začínajú samotné nasedanie o niekoľko stupňov pod vypočítanou hodnotou Tm a potom teplotu upravujú podľa výsledku na géli. Pri dvojici primerov sa ako východiskový bod zvyčajne používa nižšia z hodnôt Tm oboch primerov. Gradientová PCR, pri ktorej prebieha súčasne niekoľko reakcií v rozsahu rôznych teplôt, je bežným spôsobom hľadania najvhodnejšej teploty.

Iné spôsoby odhadu Tm

Marmur-Dotyho a Wallaceove vzorce použité v tejto kalkulačke sú rýchle aproximácie založené iba na zložení báz. Existujú aj iné metódy:

• Termodynamika najbližších susedov zohľadňuje vplyv každej dvojice susedných báz na stabilitu a považuje sa za presnejšiu metódu pre štandardné primery.
• Vzorce korigované podľa koncentrácie solí pridávajú korekciu na koncentráciu iónov Na+ alebo K+ v reakčnom pufri, pretože vyššia koncentrácia solí stabilizuje duplex DNA a zvyšuje Tm.

Rôzne kalkulačky môžu pre ten istý primer uvádzať odlišné hodnoty Tm, pretože používajú rôzne vzorce. Konečným testom zostáva vykonanie PCR a overenie výsledku.

Najčastejšie otázky

Čo je nasedacia teplota DNA?

Je to teplota, pri ktorej sa DNA primery počas PCR viažu na zodpovedajúcu sekvenciu templátového vlákna. V laboratóriách sa zvyčajne nastavuje o niekoľko stupňov nižšie než vypočítaná teplota topenia (Tm) primeru.

Ako sa vypočítava Tm primeru?

Pri primeroch s dĺžkou 14 báz alebo viac platí Tm = 64,9 + 41 × (počet báz GC − 16,4) / dĺžka. Pri primeroch kratších než 14 báz platí Tm = 2 × (počet báz A+T) + 4 × (počet báz G+C).

Prečo obsah GC zvyšuje Tm?

Páry báz G-C vytvárajú tri vodíkové väzby, zatiaľ čo páry A-T dve. Primer s vyšším podielom báz G a C potrebuje na oddelenie od svojho cieľa viac energie, a teda vyššiu teplotu.

Má sa nasedacia teplota pri PCR rovnať vypočítanej hodnote Tm?

Nie. Väčšina protokolov začína niekoľko stupňov pod vypočítanou hodnotou Tm a potom teplotu upravuje, pretože Tm označuje bod, pri ktorom je naviazaná iba polovica primeru.

Mení dĺžka primeru hodnotu Tm?

Áno, hoci nie jednoduchým spôsobom. Dĺžka sa vo vzorci Marmur-Doty nachádza v menovateli, takže dlhší primer s priemerným obsahom GC nemá automaticky vyššiu Tm než kratší primer s vysokým obsahom GC.

Prečo sa rôzne kalkulačky Tm nezhodujú?

Používajú rôzne vzorce. Wallaceovo pravidlo, vzorec obsahu GC podľa Marmura a Dotyho, termodynamika najbližších susedov a vzorce korigované podľa koncentrácie solí môžu pre ten istý primer poskytnúť odlišné hodnoty Tm, niekedy s rozdielom niekoľkých stupňov.

Referencie

1. Marmur J, Doty P. Určenie zloženia báz deoxyribonukleovej kyseliny na základe teploty tepelnej denaturácie. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Hybridizácia syntetických oligodeoxyribonukleotidov s DNA phi chi 174. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. Jednotný pohľad na termodynamiku DNA polymérov, DNA v tvare činky a oligonukleotidov z hľadiska najbližších susedov. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.