Kalkulačka koncentrácie proteínov | A280 na mg/mL

Kalkulačka koncentrácie proteínu

Kalkulačka koncentrácie proteínu prevádza hodnotu absorbancie svetla zo spektrofotometra na množstvo proteínu rozpusteného v roztoku. Výsledok sa zvyčajne uvádza v miligramoch na mililiter (mg/mL) alebo mikrogramoch na mililiter (μg/mL). Výpočet vychádza z Beerovho-Lambertovho zákona, vzťahu v chémii, ktorý spája množstvo svetla absorbovaného vzorkou s množstvom látky, ktorú obsahuje.

Ako sa meria koncentrácia proteínu

Väčšina proteínov silno absorbuje ultrafialové svetlo pri vlnovej dĺžke 280 nanometrov (nm). Táto absorpcia pochádza najmä z dvoch aminokyselín, tryptofánu a tyrozínu, ktoré sa nachádzajú v štruktúre proteínu. Spektrofotometer vysiela svetlo cez vzorku a meria, akú jeho časť vzorka absorbuje. Táto hodnota sa nazýva absorbancia alebo A280, ak sa meria pri 280 nm.

Meranie absorbancie pri 280 nm je rýchle a neničí vzorku. Tým sa odlišuje od chemických metód, ako sú testy Bradford alebo BCA, opísané nižšie. Metóda najlepšie funguje pri purifikovanom proteíne v roztoku s absorbanciou približne medzi 0,1 a 1,0. Hodnoty mimo tohto rozsahu sú menej spoľahlivé, preto sa vzorka pred meraním často musí zriediť.

Vzorec na výpočet koncentrácie proteínu

Kalkulačka upravuje Beerov-Lambertov zákon tak, aby vypočítala koncentráciu:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — koncentrácia proteínu v mg/mL
• A — absorbancia pri 280 nm (prosté číslo bez jednotky)
• DF — faktor zriedenia, teda koľkokrát bola pôvodná vzorka zriedená pred meraním
• ε — extinkčný koeficient, konštanta špecifická pre daný proteín, v L/(g·cm)
• l — dĺžka optickej dráhy, vzdialenosť, ktorú svetlo prejde vzorkou, v cm (v štandardnej kyvete, malej sklenenej alebo plastovej nádobke používanej v spektrofotometri, zvyčajne 1 cm)

Ak chcete výsledok previesť na mikrogramy na mililiter, vynásobte hodnotu v mg/mL číslom 1 000. Celkovú hmotnosť proteínu vo vzorke získate vynásobením koncentrácie objemom vzorky v mililitroch.

Príklad s riešením

Vzorka má absorbanciu 0,5 pri 280 nm. Nebola zriedená, takže faktor zriedenia je 1, a merala sa v štandardnej kyvete s dĺžkou optickej dráhy 1 cm. Proteínom je hovädzí sérový albumín (BSA), ktorý má extinkčný koeficient 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

V 1 mL vzorke to predstavuje približne 0,75 mg celkového proteínu alebo 750 μg/mL.

Extinkčné koeficienty bežných proteínov

Každý proteín absorbuje svetlo odlišne, pretože obsahuje iný počet zvyškov tryptofánu a tyrozínu. Extinkčný koeficient to vyjadruje pre konkrétny proteín pri 280 nm v jednotkách L/(g·cm). Medzi bežne používané hodnoty patria:

Kalkulačka môže prijať aj vlastný extinkčný koeficient pre proteín, ktorý nie je na tomto zozname. Pri proteíne so známou sekvenciou aminokyselín možno túto hodnotu odhadnúť pomocou vzorca, ktorý Gill a von Hippel publikovali v roku 1989: ε₂₈₀ = (zvyšky tryptofánu × 5 500) + (zvyšky tyrozínu × 1 490) + (zvyšky cystínu × 125). Vzorec poskytuje výsledok v M⁻¹cm⁻¹, molárnej jednotke, ktorá sa líši od vyššie uvedených hmotnostných hodnôt v L/(g·cm). Bezplatné nástroje, ako napríklad ProtParam na serveri ExPASy, vypočítajú túto hodnotu priamo zo sekvencie proteínu.

Dĺžka optickej dráhy a faktor zriedenia

Dĺžka optickej dráhy je šírka kyvety obsahujúcej vzorku, meraná v centimetroch. Štandardné kyvety sú široké 1 cm. Mikroobjemové spektrofotometre, ktoré merajú veľmi malé vzorky, môžu používať oveľa kratšiu optickú dráhu, napríklad 0,1 cm.

Faktor zriedenia zohľadňuje každé zriedenie vykonané pred meraním. Ak by koncentrovaná vzorka mala absorbanciu vyššiu ako 1,0, bežne sa najprv zriedi pufrom. Faktor zriedenia sa rovná celkovému objemu zriedenej vzorky delenému pôvodným objemom vzorky. Napríklad zmiešaním 10 μL vzorky s 990 μL pufra vznikne celkový objem 1 000 μL a faktor zriedenia je 100.

Iné spôsoby merania koncentrácie proteínu

Absorbancia pri 280 nm je jednou z niekoľkých bežných metód používaných v laboratóriu.

• Bradfordov test: využíva farbivo, ktoré po naviazaní na proteín zmení farbu. Funguje dobre pri nepurifikovaných vzorkách, ale zmena farby sa môže medzi rôznymi proteínmi líšiť.
• BCA test: je založený na zmene farby spôsobenej peptidovými väzbami proteínu. Je kompatibilný s mnohými detergentmi, ale jeho vykonanie trvá dlhšie než pri priamom meraní absorbancie.
• Lowryho metóda: staršia metóda s veľmi vysokou citlivosťou, ktorá však slabo reaguje s niektorými bežnými zložkami pufrov.

Každá z týchto troch metód vzorku zničí. Priame meranie A280 ju neničí, takže tú istú vzorku možno získať späť a znova použiť.

Najčastejšie otázky

Aký je ideálny rozsah absorbancie pre túto metódu?

Medzi 0,1 a 1,0. Pod 0,1 je meranie nepresné. Nad 1,0 už vzťah medzi absorbanciou a koncentráciou nemusí byť lineárny, preto treba vzorku najprv zriediť.

Prečo sa meria pri 280 nm namiesto 260 nm?

Nukleové kyseliny, napríklad DNA a RNA, silno absorbujú pri 260 nm. Proteíny absorbujú viac pri 280 nm vďaka obsahu tryptofánu a tyrozínu. Meranie pri 280 nm znižuje rušenie spôsobené nukleovými kyselinami prítomnými vo vzorke.

Ako sa určuje extinkčný koeficient proteínu, ktorý nie je na zozname?

Pri proteíne so známou sekvenciou ho nástroj, ako napríklad ProtParam, vypočíta z počtu zvyškov tryptofánu, tyrozínu a cystínu. Možno ho tiež zmerať priamo porovnaním absorbancie vzorky s roztokom so známou koncentráciou.

Funguje táto metóda pri zmesi proteínov?

Najlepšie funguje pri jednom purifikovanom proteíne so známym extinkčným koeficientom. Zmes neznámych proteínov, napríklad bunkový lyzát, sa zvyčajne meria Bradfordovým alebo BCA testom, pretože tieto metódy poskytujú konzistentnejší odhad celkového množstva proteínu.

Môžu detergenty rušiť meranie?

Áno. Mnohé detergenty absorbujú svetlo v blízkosti 280 nm, čo môže skresliť výsledok. Použitie slepej vzorky s rovnakou koncentráciou detergentu pomáha odčítať túto absorbanciu pozadia. Pri veľmi vysokých koncentráciách detergentu môže byť namiesto toho potrebný test kompatibilný s detergentmi, napríklad BCA test.