Kalibračná krivka Kalkulačka | Lineárna regresia pre laboratórnu analýzu

Čo je kalkulačka kalibračnej krivky

Kalkulačka kalibračnej krivky prevádza namerané hodnoty prístroja na koncentrácie. Robí to tak, že pomocou údajov zo štandardov so známou koncentráciou preloží priamku cez dátové body a potom túto priamku použije na prevod novej nameranej hodnoty na koncentráciu. Kalibračné krivky sa používajú v chemických, biologických a environmentálnych laboratóriách vždy, keď prístroj uvádza signál, napríklad absorbanciu alebo plochu píku, a nie priamo koncentráciu.

Kalkulačka na tejto stránke prekladá priamku pomocou lineárnej regresie, teda metódy najmenších štvorcov. Uvádza smernicu, priesečník s osou y a R², mieru toho, ako presne body sledujú priamku. Potom môže odhadnúť koncentráciu neznámej vzorky z nameranej odozvy.

Vzorec kalibračnej krivky

Kalibračná krivka predpokladá lineárny vzťah medzi koncentráciou a odozvou prístroja:

$y = mx + b$

• $y$ je odozva (to, čo prístroj meria)
• $x$ je koncentrácia
• $m$ je smernica
• $b$ je úsek na osi y

Ako vypočítať smernicu a priesečník s osou y

Pre súbor $n$ bodov sú smernica a úsek, ktoré najlepšie vyhovujú údajom (v zmysle metódy najmenších štvorcov), takéto:

$m = \frac{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})(y_i - \bar{y})}{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})^2}$

$b = \bar{y} - m\bar{x}$

Tu $\bar{x}$ a $\bar{y}$ predstavujú priemernú koncentráciu a priemernú odozvu všetkých bodov.

Vzorec R²

R², koeficient determinácie, ukazuje, ako dobre priamka vyhovuje údajom:

$R^2 = 1 - \frac{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \hat{y}_i)^2}{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \bar{y})^2}$

$\hat{y}_i$ je odozva, ktorú priamka predpovedá pre každé $x_i$. R² nadobúda hodnoty od 0 do 1. Hodnota 1 znamená, že každý bod leží presne na priamke.

Vzorec pre koncentráciu neznámej vzorky

Po určení smernice a priesečníka s osou y možno nameranú odozvu $y$ spätne previesť na koncentráciu:

$x = \frac{y - b}{m}$

Ak je výsledkom tohto výpočtu záporné číslo, kalkulačka uvedie koncentráciu ako 0, pretože záporná koncentrácia nemá fyzikálny význam. Hodnotu 0 uvedie aj vtedy, keď je smernica regresnej priamky 0, pretože vodorovná priamka neposkytuje o koncentrácii žiadnu informáciu.

Vyriešený príklad

Predpokladajme, že štyri štandardy poskytli tieto výsledky:

Priemerná koncentrácia je 3 a priemerná odozva je 0,20.

Smernica:

$m = \frac{(-3)(-0.15) + (-1)(-0.05) + (1)(0.04) + (3)(0.16)}{(-3)^2 + (-1)^2 + 1^2 + 3^2} = \frac{1.02}{20} = 0.0510$

Priesečník s osou y:

$b = 0.20 - (0.0510)(3) = 0.0470$

R²: porovnanie predpovedaných odoziev so skutočnými poskytuje R² = 0,9966.

Regresná priamka je:

$y = 0.0510x + 0.0470 \quad (R^2 = 0.9966)$

Teraz predpokladajme, že neznáma vzorka poskytne odozvu 0,20. Jej koncentrácia je:

$x = \frac{0.20 - 0.0470}{0.0510} = 3.0000$

Ako používať túto kalkulačku

1. Zadajte známu koncentráciu každého štandardu a jeho nameranú odozvu ako dvojicu čísel. Kalkulačka začína s dvoma riadkami.
2. Vyberte „Pridať dátový bod“, ak chcete zadať ďalšie štandardy, alebo „Odstrániť dátový bod“ vedľa riadka, ak ho chcete vymazať. Vyžadujú sa aspoň dva body.
3. Keď sú vyplnené aspoň dva body, kalkulačka zobrazí regresnú rovnicu, hodnotu R² a graf bodov s vypočítanou priamkou. Smernica, úsek, R² a koncentrácia sa na zobrazenie zaokrúhľujú na štyri desatinné miesta.
4. Zadajte nameranú odozvu v časti „Vypočítať koncentráciu neznámej vzorky“ a zobrazí sa príslušná koncentrácia. Aktualizuje sa automaticky počas zadávania hodnoty; netreba stlačiť samostatné tlačidlo.
5. Vyberte „Obnoviť“, ak chcete vymazať všetky zadané body aj pole s odozvou a začať znova.

Interpretácia smernice, úseku a R²

Smernica ukazuje, o koľko sa mení odozva na jednotku koncentrácie. Väčšia smernica znamená, že metóda výrazne reaguje na malé zmeny koncentrácie.

Priesečník s osou y je predpovedaná odozva pri nulovej koncentrácii. Odráža signál pozadia, napríklad slepú vzorku alebo základnú čiaru prístroja. Nenulový priesečník s osou y je bežný a automaticky neznamená problém, ale veľký alebo nekonzistentný priesečník s osou y medzi kalibráciami môže poukazovať na kontamináciu alebo poruchu prístroja.

R² ukazuje, ako presne body sledujú priamku. Hodnoty nad 0,99 sú typické pre dobre fungujúcu lineárnu metódu. Nižšie R² môže znamenať chybu pri pipetovaní, degradovaný štandard alebo rozsah koncentrácií, v ktorom odozva už nie je lineárna.

Kde sa používajú kalibračné krivky

Kalibračné krivky sa bežne používajú všade tam, kde treba surový signál prístroja previesť na koncentráciu:

• Spektrofotometria — meria sa absorbancia svetla a prevádza sa na koncentráciu, napríklad pri meraní obsahu bielkovín alebo pigmentov.
• Chromatografia (HPLC, GC) — plocha alebo výška píku z chromatogramu sa prevádza na koncentráciu, čo je bežné pri testovaní liečiv a environmentálnych analýzach.
• ELISA a iné imunoanalýzy — intenzita zafarbenia alebo fluorescencie z čítačky mikrotitračných platničiek sa prevádza na koncentráciu antigénu alebo protilátky.
• qPCR — prahové hodnoty cyklu zo sériových riedení známej vzorky vytvárajú krivku, ktorá sa používa na odhad množstva genetického materiálu v neznámej vzorke.

Keď priamka nevyhovuje

Niektoré metódy nie sú lineárne v celom svojom rozsahu. Bežné riešenia zahŕňajú obmedzenie kalibrácie na užšiu lineárnu oblasť, logaritmickú transformáciu pred samotným prispôsobením priamky, použitie polynomického (krivkového) prispôsobenia alebo váženej regresie, keď sa chyba merania s koncentráciou zväčšuje alebo zmenšuje. Táto kalkulačka prispôsobuje iba priamku; ak sa body zjavne zakrivujú, výsledky budú menej spoľahlivé a môže byť potrebný iný model.

Najčastejšie otázky

Čo je kalibračná krivka?

Kalibračná krivka je priamka preložená cez namerané hodnoty prístroja pre vzorky so známou koncentráciou. Používa sa na prevod novej nameranej hodnoty zo vzorky s neznámou koncentráciou na hodnotu koncentrácie.

Koľko dátových bodov potrebuje kalibračná krivka?

Kalkulačka potrebuje na preloženie priamky aspoň dva body, ale dva body nemôžu ukázať, či je skutočný vzťah naozaj priamkový. Väčšina laboratórií používa päť až osem štandardov pokrývajúcich očakávaný rozsah koncentrácií neznámych vzoriek.

Čo znamená R² pri kalibračnej krivke?

R² meria, ako presne dátové body sledujú vypočítanú priamku, na stupnici od 0 do 1. Hodnota 1 znamená, že každý bod leží presne na priamke. Hodnoty nad 0,99 sa všeobecne považujú za silný dôkaz lineárneho vzťahu.

Možno odhadovať koncentrácie mimo rozsahu štandardov?

Odhad koncentrácie nižšej než najnižší štandard alebo vyššej než najvyšší štandard je nespoľahlivý, pretože neexistujú údaje potvrdzujúce, že priamka tam zostáva priamkou. Vzorku s príliš vysokou nameranou hodnotou je lepšie zriediť a vzorku s príliš nízkou nameranou hodnotou skoncentrovať, potom meranie zopakovať v rámci kalibrovaného rozsahu.

Prečo sa vypočítaná koncentrácia niekedy zobrazuje ako 0?

Ak je nameraná odozva nižšia než odhadovaný priesečník s osou y (pri kladnej smernici), vzorec $x = (y - b) / m$ poskytne záporné číslo. Kalkulačka v takom prípade zobrazí 0, pretože skutočná koncentrácia nemôže byť záporná. Hodnotu 0 zobrazí aj vtedy, keď je smernica 0, čo nastane, ak má každý štandard rovnakú odozvu alebo rovnakú koncentráciu.

Aký je rozdiel medzi smernicou a priesečníkom s osou y?

Smernica opisuje citlivosť odozvy na zmenu koncentrácie. Priesečník s osou y je odozva predpovedaná pri nulovej koncentrácii a často odráža signál pozadia, nie samotného analytu.