Cellutspädningsräknare - Exakt laboratorieutspädningsverktyg

Kalkylator för cellspädning

En kalkylator för cellspädning beräknar hur mycket cellsuspension och spädningsvätska som ska blandas för att nå en önskad cellkoncentration i en vald slutvolym. Den används vid cellodling, mikrobiologi och annat laboratoriearbete där ett prov måste ha en exakt koncentration före användning.

Vad cellspädning innebär

Spädning av en cellsuspension ändrar inte hur många celler den innehåller. Den ändrar bara den volym som cellerna befinner sig i, vilket sänker koncentrationen. En suspension som räknats till 1 000 000 celler per milliliter (celler/mL) innehåller fortfarande samma totala antal celler efter spädningen. Antalet är helt enkelt fördelat över mer vätska.

Laboratorier späder celler före många rutinmoment: när en växande odling delas upp i nya odlingsflaskor, när ett bestämt antal celler sås i varje brunn i en platta, när celler fryses för förvaring eller när ett prov förbereds för en cellräknare eller flödescytometer.

Formel för cellspädning

Beräkningen bygger på en regel. Antalet celler som tas från stamlösningen, multiplicerat med dess koncentration, måste vara lika med antalet celler i slutvolymen, multiplicerat med målkoncentrationen:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — utgångskoncentration (stamlösningens koncentration), i celler/mL
• V₁ — volym stamlösning som ska användas, i mL
• C₂ — målkoncentration, i celler/mL
• V₂ — total erforderlig slutvolym, i mL

Om man löser ut V₁ får man den volym stamlösning som ska pipetteras:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Resten av slutvolymen består av spädningsvätska, vanligtvis cellodlingsmedium, fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller en annan buffert:

Volym spädningsvätska = V₂ − V₁

Målkoncentrationen (C₂) kan aldrig vara högre än stamlösningens koncentration (C₁). Spädning sänker bara koncentrationen. För att höja den måste cellerna centrifugeras ned och resuspenderas i mindre vätskevolym.

Så beräknas en cellspädning

1. Räkna cellerna i stamlösningen med en hemocytometer eller en automatisk cellräknare för att få fram C₁.
2. Notera den målkoncentration, C₂, som protokollet kräver.
3. Bestäm den totala slutvolym, V₂, som behövs.
4. Beräkna V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
5. Beräkna volymen spädningsvätska som V₂ − V₁.
6. Pipettera V₁ stamlösning i ett rör och tillsätt därefter den beräknade volymen medium eller buffert.

Räkneexempel

En stamlösning har en koncentration på 1 000 000 celler/mL. Ett protokoll kräver 100 000 celler/mL i en slutvolym på 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100 000 × 10) ÷ 1 000 000 = 1 000 000 ÷ 1 000 000 = 1 mL

Volym spädningsvätska = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Om 1 mL stamlösning tas och 9 mL medium tillsätts, erhålls 10 mL suspension med 100 000 celler/mL.

Ett andra exempel

En analys i en platta med 96 brunnar kräver 10 000 celler per brunn i 200 mikroliter (μL) medium per brunn. Det motsvarar en målkoncentration på 50 000 celler/mL, eftersom 10 000 celler delat med 0,2 mL är lika med 50 000 celler/mL. Stamlösningen har en koncentration på 2 000 000 celler/mL, och totalt 20 mL behövs för att täcka plattan med viss extra volym för pipetteringsförluster.

V₁ = (50 000 × 20) ÷ 2 000 000 = 1 000 000 ÷ 2 000 000 = 0,5 mL

Volym spädningsvätska = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Om 0,5 mL stamlösning blandas med 19,5 mL medium erhålls 20 mL med 50 000 celler/mL, en spädning på 1 till 40.

Felkällor

Själva formeln är exakt. Felen uppstår i de värden som matas in i den.

• Räknefel. Ett felaktigt cellantal leder direkt till en felaktig spädning. Risken minskar om alla fyra hörnrutor i hemocytometergallret räknas och medelvärdet beräknas.
• Cellklumpar. En cellklump ser ut som en enda cell i mikroskopet men består egentligen av flera celler, vilket sänker den skenbara koncentrationen.
• Pipettens volymområde. En pipett som används utanför sitt angivna volymområde ger felaktiga resultat. En pipett på 1000 μL som ställts in för att dispensera 5 μL är inte tillförlitlig; i stället bör en mindre pipett användas.
• Enhetsförväxlingar. Om celler/mL blandas ihop med celler/μL blir felet tusen gånger för stort eller för litet.
• Döda celler. En obehandlad cellräkning inkluderar döda celler om inte en viabilitetsfärgning, till exempel trypanblått, har använts. Det kan överskatta antalet levande celler som faktiskt finns.

Begränsningar hos denna kalkylator

Kalkylatorn avvisar värden som den inte kan ge ett användbart svar för:

• Alla värden måste vara större än noll.
• Målkoncentrationen kan inte vara högre än utgångskoncentrationen.
• Utgångskoncentrationen måste vara 1 biljon celler/mL (1 × 10¹²) eller lägre.
• Den beräknade volymen stamlösning måste vara minst 0,001 mL, vilket motsvarar 1 mikroliter. Mindre volymer kan inte pipetteras noggrant, så kalkylatorn ber om andra värden. Detta löses vanligtvis genom att öka den totala volymen.

Volymer visas med två decimaler, eller med tre när stamlösningens volym är mindre än 0,01 mL, så att en liten volym aldrig visas som 0,00 mL.

Vanliga frågor

Vilken är formeln för cellspädning?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, där C₁ och C₂ är utgångs- respektive målkoncentrationen, och V₁ och V₂ är volymen som tas från stamlösningen respektive den totala slutvolymen.

Kan målkoncentrationen vara högre än utgångskoncentrationen?

Nej. Spädning sänker bara koncentrationen. För att nå en högre koncentration måste cellerna centrifugeras och resuspenderas i en mindre volym.

Vilken vätska bör användas för att späda celler?

Komplett odlingsmedium används när cellerna måste hållas friska i timmar eller dagar, till exempel före sådd i en platta. PBS eller en liknande buffrad saltlösning fungerar vid korta spädningar, under cirka 30 minuter, innan cellerna bearbetas vidare. Serumfritt medium används när serumproteiner skulle störa en efterföljande analys.

Fungerar denna formel för bakterier eller jäst?

Ja. C₁V₁ = C₂V₂ gäller för alla suspensioner av partiklar, inklusive bakterier som mäts i kolonibildande enheter per milliliter (CFU/mL), jäst och viruspartiklar som mäts i plackbildande enheter per milliliter (PFU/mL), så länge samma enheter används på båda sidor av ekvationen.

Ska döda celler räknas med i spädningen?

Vid sådd av en levande odling ska endast livskraftiga celler räknas. Om en suspension har 80 % viabilitet är dess koncentration av livskraftiga celler 0,8 gånger det totala cellantalet, och denna koncentration ska användas som C₁.

Hur kan mycket stora spädningar göras noggrant?

Stora spädningar, till exempel 1 till 1000, görs vanligtvis som en serie mindre steg som kallas seriella spädningar. Tre på varandra följande spädningar på 1 till 10 ger totalt en spädning på 1 till 1000, samtidigt som varje pipetteringssteg hålls inom ett volymintervall som kan pipetteras noggrant.