เครื่องคำนวณการเจือจางเซลล์ - เครื่องมือเจือจางในห้องปฏิบัติการที่แม่นยำ

เครื่องคำนวณการเจือจางเซลล์

เครื่องคำนวณการเจือจางเซลล์ใช้หาปริมาตรสารแขวนลอยเซลล์และสารเจือจางที่ต้องผสมกัน เพื่อให้ได้ความเข้มข้นของเซลล์ตามเป้าหมายในปริมาตรสุดท้ายที่กำหนด ใช้ในงานเพาะเลี้ยงเซลล์ จุลชีววิทยา และงานห้องปฏิบัติการอื่น ๆ ที่ต้องปรับตัวอย่างให้มีความเข้มข้นที่แน่นอนก่อนใช้งาน

ความหมายของการเจือจางเซลล์

การเจือจางสารแขวนลอยเซลล์ไม่ได้เปลี่ยนจำนวนเซลล์ที่มีอยู่ แต่เปลี่ยนเฉพาะปริมาตรของของเหลวที่เซลล์กระจายอยู่ ทำให้ความเข้มข้นลดลง สารแขวนลอยที่ตรวจนับได้ 1,000,000 เซลล์ต่อมิลลิลิตร (เซลล์/มล.) ยังคงมีจำนวนเซลล์ทั้งหมดเท่าเดิมหลังการเจือจาง เพียงแต่จำนวนดังกล่าวกระจายอยู่ในของเหลวที่มีปริมาตรมากขึ้น

ห้องปฏิบัติการเจือจางเซลล์ก่อนทำขั้นตอนทั่วไปหลายอย่าง เช่น แบ่งเซลล์จากการเพาะเลี้ยงที่กำลังเจริญไปใส่ขวดเพาะเลี้ยงใหม่ หยอดเซลล์ตามจำนวนที่กำหนดลงในแต่ละหลุมของเพลต แช่แข็งเซลล์เพื่อเก็บรักษา หรือเตรียมตัวอย่างสำหรับเครื่องนับเซลล์หรือโฟลว์ไซโตมิเตอร์

สูตรการเจือจางเซลล์

การคำนวณอาศัยกฎข้อเดียว คือ จำนวนเซลล์ที่นำมาจากสารแขวนลอยตั้งต้นคูณด้วยความเข้มข้น ต้องเท่ากับจำนวนเซลล์ในปริมาตรสุดท้ายคูณด้วยความเข้มข้นเป้าหมาย:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — ความเข้มข้นเริ่มต้น (ของสารตั้งต้น) หน่วยเป็นเซลล์/มล.
• V₁ — ปริมาตรของสารแขวนลอยตั้งต้นที่ใช้ หน่วยเป็นมล.
• C₂ — ความเข้มข้นเป้าหมาย หน่วยเป็นเซลล์/มล.
• V₂ — ปริมาตรสุดท้ายรวมที่ต้องการ หน่วยเป็นมล.

เมื่อแก้สมการหา V₁ จะได้ปริมาตรของสารแขวนลอยตั้งต้นที่ต้องดูดด้วยปิเปต:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

ส่วนที่เหลือของปริมาตรสุดท้ายคือสารเจือจาง ซึ่งโดยทั่วไปได้แก่ อาหารเลี้ยงเซลล์ สารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) หรือบัฟเฟอร์ชนิดอื่น:

ปริมาตรสารเจือจาง = V₂ − V₁

ความเข้มข้นเป้าหมาย (C₂) ไม่สามารถสูงกว่าความเข้มข้นของสารตั้งต้น (C₁) ได้ การเจือจางทำให้ความเข้มข้นลดลงเท่านั้น หากต้องการเพิ่มความเข้มข้น ต้องปั่นเหวี่ยงให้เซลล์ตกตะกอนแล้วแขวนลอยใหม่ในของเหลวที่มีปริมาตรน้อยลง

วิธีคำนวณการเจือจางเซลล์

1. ตรวจนับสารแขวนลอยตั้งต้นด้วยเฮโมไซโตมิเตอร์หรือเครื่องนับเซลล์อัตโนมัติ เพื่อหาค่า C₁
2. ระบุความเข้มข้นเป้าหมาย C₂ ตามที่โพรโทคอลกำหนด
3. กำหนดปริมาตรสุดท้ายรวม V₂ ที่ต้องการ
4. คำนวณ V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁
5. คำนวณปริมาตรสารเจือจางเป็น V₂ − V₁
6. ดูดสารแขวนลอยตั้งต้นปริมาตร V₁ ใส่หลอด แล้วเติมอาหารเลี้ยงเซลล์หรือบัฟเฟอร์ให้ได้ปริมาตรสารเจือจางตามที่คำนวณ

ตัวอย่างพร้อมวิธีทำ

สารแขวนลอยตั้งต้นมีความเข้มข้น 1,000,000 เซลล์/มล. โพรโทคอลกำหนดให้มีความเข้มข้น 100,000 เซลล์/มล. ในปริมาตรสุดท้าย 10 มล.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100,000 × 10) ÷ 1,000,000 = 1,000,000 ÷ 1,000,000 = 1 มล.

ปริมาตรสารเจือจาง = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 มล.

การนำสารแขวนลอยตั้งต้น 1 มล. มาผสมกับอาหารเลี้ยงเซลล์ 9 มล. จะได้สารแขวนลอย 10 มล. ที่มีความเข้มข้น 100,000 เซลล์/มล.

ตัวอย่างที่สอง

การทดสอบด้วยเพลต 96 หลุมต้องใช้เซลล์ 10,000 เซลล์ต่อหลุม ในอาหารเลี้ยงเซลล์ 200 ไมโครลิตร (μL) ต่อหลุม จึงมีความเข้มข้นเป้าหมาย 50,000 เซลล์/มล. เนื่องจาก 10,000 เซลล์หารด้วย 0.2 มล. เท่ากับ 50,000 เซลล์/มล. สารตั้งต้นมีความเข้มข้น 2,000,000 เซลล์/มล. และต้องใช้ปริมาตรรวม 20 มล. เพื่อให้เพียงพอสำหรับทั้งเพลตและมีส่วนเผื่อการสูญเสียขณะดูดจ่าย

V₁ = (50,000 × 20) ÷ 2,000,000 = 1,000,000 ÷ 2,000,000 = 0.5 มล.

ปริมาตรสารเจือจาง = 20 − 0.5 = 19.5 มล.

การผสมสารแขวนลอยตั้งต้น 0.5 มล. กับอาหารเลี้ยงเซลล์ 19.5 มล. จะได้ปริมาตร 20 มล. ที่มีความเข้มข้น 50,000 เซลล์/มล. ซึ่งเป็นการเจือจาง 1 ต่อ 40

แหล่งที่มาของความคลาดเคลื่อน

ตัวสูตรเองมีความแม่นยำ ความคลาดเคลื่อนเกิดจากตัวเลขที่นำมาใส่ในสูตร

• ความคลาดเคลื่อนในการนับ การนับเซลล์ผิดทำให้การเจือจางผิดตามไปด้วย การนับทั้งสี่ช่องมุมของตารางเฮโมไซโตมิเตอร์แล้วหาค่าเฉลี่ยช่วยลดความเสี่ยงนี้
• เซลล์เกาะกลุ่ม กลุ่มเซลล์ดูเหมือนเป็นเซลล์เดียวเมื่อมองด้วยกล้องจุลทรรศน์ แต่แท้จริงประกอบด้วยหลายเซลล์ จึงทำให้ความเข้มข้นที่ประเมินได้ต่ำกว่าความเป็นจริง
• ช่วงปริมาตรของปิเปต ปิเปตที่ใช้นอกช่วงปริมาตรที่กำหนดจะให้ผลไม่แม่นยำ ปิเปต 1000 μL ที่ตั้งให้จ่าย 5 μL ไม่น่าเชื่อถือ ควรใช้ปิเปตขนาดเล็กกว่าแทน
• การสับสนหน่วย การนำหน่วยเซลล์/มล. มาปะปนกับเซลล์/μล. ทำให้เกิดความคลาดเคลื่อนมากหรือน้อยเกินจริงถึงหนึ่งพันเท่า
• เซลล์ตาย การนับเซลล์โดยไม่ย้อมสีจะรวมเซลล์ตายด้วย เว้นแต่จะใช้สีย้อมตรวจความมีชีวิต เช่น ทริแพนบลู ซึ่งอาจทำให้จำนวนเซลล์มีชีวิตที่มีอยู่จริงถูกประเมินสูงเกินไป

ข้อจำกัดของเครื่องคำนวณนี้

เครื่องคำนวณจะปฏิเสธตัวเลขที่ไม่สามารถใช้คำนวณได้อย่างมีประโยชน์:

• ทุกค่าต้องมากกว่าศูนย์
• ความเข้มข้นเป้าหมายต้องไม่สูงกว่าความเข้มข้นเริ่มต้น
• ความเข้มข้นเริ่มต้นต้องไม่เกิน 1 ล้านล้านเซลล์/มล. (1 × 10¹²)
• ปริมาตรสารตั้งต้นที่คำนวณได้ต้องไม่น้อยกว่า 0.001 มล. ซึ่งเท่ากับ 1 ไมโครลิตร ปริมาตรที่เล็กกว่านี้ไม่สามารถดูดจ่ายได้อย่างแม่นยำ เครื่องคำนวณจึงขอให้ใช้ตัวเลขอื่นแทน การเพิ่มปริมาตรรวมมักช่วยแก้ปัญหานี้ได้

ปริมาตรจะแสดงเป็นทศนิยมสองตำแหน่ง หรือสามตำแหน่งเมื่อปริมาตรสารตั้งต้นน้อยกว่า 0.01 มล. เพื่อไม่ให้ปริมาตรเล็ก ๆ แสดงเป็น 0.00 มล.

คำถามที่พบบ่อย

สูตรการเจือจางเซลล์คืออะไร?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂ โดย C₁ และ C₂ คือความเข้มข้นเริ่มต้นและความเข้มข้นเป้าหมาย ส่วน V₁ และ V₂ คือปริมาตรที่นำมาจากสารตั้งต้นและปริมาตรสุดท้ายรวม

ความเข้มข้นเป้าหมายสูงกว่าความเข้มข้นเริ่มต้นได้หรือไม่?

ไม่ได้ การเจือจางทำให้ความเข้มข้นลดลงเท่านั้น หากต้องการความเข้มข้นที่สูงขึ้น ต้องปั่นเหวี่ยงเซลล์แล้วแขวนลอยใหม่ในปริมาตรที่น้อยลง

ควรใช้ของเหลวชนิดใดเจือจางเซลล์?

ใช้อาหารเลี้ยงเซลล์สมบูรณ์เมื่อเซลล์ต้องคงสภาพมีชีวิตเป็นเวลาหลายชั่วโมงหรือหลายวัน เช่น ก่อนหยอดลงในเพลต PBS หรือน้ำเกลือบัฟเฟอร์ที่คล้ายกันใช้ได้กับการเจือจางระยะสั้นไม่เกินประมาณ 30 นาที ก่อนนำเซลล์ไปผ่านกระบวนการต่อ อาหารเลี้ยงเซลล์ที่ไม่มีซีรัมใช้เมื่อโปรตีนในซีรัมอาจรบกวนการทดสอบในขั้นตอนถัดไป

สูตรนี้ใช้กับแบคทีเรียหรือยีสต์ได้หรือไม่?

ได้ C₁V₁ = C₂V₂ ใช้ได้กับสารแขวนลอยของอนุภาคทุกชนิด รวมถึงแบคทีเรียที่วัดเป็นหน่วยก่อโคโลนีต่อมิลลิลิตร (CFU/mL) ยีสต์ และอนุภาคไวรัสที่วัดเป็นหน่วยก่อพลัคต่อมิลลิลิตร (PFU/mL) ตราบใดที่ใช้หน่วยเดียวกันทั้งสองข้างของสมการ

ควรนับเซลล์ตายในการเจือจางหรือไม่?

หากใช้สำหรับหยอดเซลล์ที่มีชีวิต ควรนับเฉพาะเซลล์ที่มีชีวิตเท่านั้น หากสารแขวนลอยมีเซลล์ที่มีชีวิต 80% ความเข้มข้นของเซลล์ที่มีชีวิตจะเท่ากับ 0.8 เท่าของจำนวนเซลล์ทั้งหมด และควรใช้ความเข้มข้นดังกล่าวเป็นค่า C₁

จะเจือจางในอัตราสูงมากให้แม่นยำได้อย่างไร?

การเจือจางในอัตราสูง เช่น 1 ต่อ 1000 โดยทั่วไปทำเป็นขั้นตอนย่อยต่อเนื่องที่เรียกว่าการเจือจางแบบอนุกรม การเจือจาง 1 ต่อ 10 ติดต่อกันสามครั้งจะได้การเจือจางรวม 1 ต่อ 1000 และยังทำให้แต่ละขั้นตอนการดูดจ่ายอยู่ในช่วงปริมาตรที่แม่นยำ