เครื่องคำนวณอุณหภูมิการเชื่อมสายดีเอ็นเอ | เครื่องมือหาอุณหภูมิ PCR ฟรี

เครื่องคำนวณอุณหภูมิการจับคู่สายดีเอ็นเอคืออะไร?

เครื่องคำนวณอุณหภูมิการจับคู่สายดีเอ็นเอใช้ประมาณอุณหภูมิหลอมเหลว (Tm) ของไพรเมอร์ดีเอ็นเอจากลำดับเบสของไพรเมอร์ Tm คืออุณหภูมิที่โมเลกุลไพรเมอร์ครึ่งหนึ่งจับกับสายเป้าหมาย และอีกครึ่งหนึ่งไม่จับ ในปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) ค่านี้ใช้กำหนดอุณหภูมิที่ไพรเมอร์จะจับกับแม่แบบดีเอ็นเอ

เหตุใดอุณหภูมิการจับคู่สายจึงมีความสำคัญใน PCR

PCR ทำสำเนาชิ้นส่วนดีเอ็นเอเป้าหมายผ่านรอบการให้ความร้อนและการทำให้เย็นซ้ำ ๆ แต่ละรอบมีสามขั้นตอน ขั้นแรก ให้ความร้อนเพื่อแยกแม่แบบดีเอ็นเอสายคู่ที่ประมาณ 95 °C ขั้นตอนนี้เรียกว่าการทำให้เสียสภาพ ขั้นที่สอง ลดอุณหภูมิของปฏิกิริยาลงสู่อุณหภูมิการจับคู่สาย ซึ่งโดยทั่วไปอยู่ระหว่าง 50 °C ถึง 65 °C เพื่อให้ไพรเมอร์สั้น ๆ จับกับลำดับเบสที่ตรงกันบนสายเดี่ยว ขั้นที่สาม เพิ่มอุณหภูมิขึ้นเป็นประมาณ 72 °C และเอนไซม์ที่เรียกว่าดีเอ็นเอพอลิเมอเรสจะต่อไพรเมอร์เพื่อสร้างสายดีเอ็นเอใหม่

หากอุณหภูมิการจับคู่สายต่ำเกินไป ไพรเมอร์จะจับกับลำดับเบสที่ตรงกันเพียงบางส่วน ทำให้เกิดชิ้นส่วนดีเอ็นเอส่วนเกินที่ไม่ต้องการ หากสูงเกินไป ไพรเมอร์จะสร้างพันธะที่เสถียรกับแม่แบบไม่ได้ จึงมีดีเอ็นเอถูกทำสำเนาน้อยมากหรือไม่เกิดขึ้นเลย อุณหภูมิการจับคู่สายเป็นหนึ่งในการตั้งค่าแรก ๆ ที่นักวิจัยปรับเมื่อปฏิกิริยา PCR ไม่สำเร็จ

ปริมาณ GC ส่งผลต่อ Tm อย่างไร

ไพรเมอร์จับคู่กับเป้าหมายผ่านพันธะไฮโดรเจน คู่เบสกวานีน-ไซโทซีน (G-C) สร้างพันธะไฮโดรเจนสามพันธะ ส่วนคู่เบสอะดีนีน-ไทมีน (A-T) สร้างสองพันธะ ไพรเมอร์ที่มีเบส G และ C มากกว่าจะต้องใช้ความร้อนมากกว่าในการแยกออก จึงมี Tm สูงกว่าไพรเมอร์ที่มีความยาวเท่ากันแต่มีเบส A และ T มากกว่า โดยทั่วไปปริมาณ GC เขียนเป็นเปอร์เซ็นต์ โดยนำจำนวนเบส G และ C หารด้วยความยาวลำดับเบสทั้งหมด แล้วคูณด้วย 100

สูตรคำนวณอุณหภูมิการจับคู่สายดีเอ็นเอ

เครื่องคำนวณนี้ใช้หนึ่งในสองสูตร โดยเลือกตามความยาวของไพรเมอร์

สำหรับไพรเมอร์ที่มีนิวคลีโอไทด์ 14 ตัวขึ้นไป จะใช้สูตรปริมาณ GC ของ Marmur-Doty:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

ในที่นี้ N_GC คือจำนวนเบส G และ C ในไพรเมอร์ ซึ่งนับโดยตรง ไม่ใช่ค่าร้อยละ ส่วน N คือจำนวนเบสทั้งหมด

สำหรับไพรเมอร์ที่สั้นกว่า 14 นิวคลีโอไทด์ จะใช้กฎของ Wallace:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G และ C แต่ละตัวหมายถึงจำนวนของเบสนั้นในไพรเมอร์

ทั้งสองสูตรตั้งอยู่บนสมมติฐานของสภาวะ PCR ทั่วไป ได้แก่ ไพรเมอร์ประมาณ 50 นาโนโมลาร์ และ Na+ 50 มิลลิโมลาร์

ตัวอย่างพร้อมวิธีทำ

พิจารณาไพรเมอร์ที่มี 19 เบส คือ ATGCTAGCTAGCTGCTAGC ความยาวของไพรเมอร์คือ 19 ซึ่งเท่ากับหรือมากกว่า 14 ดังนั้นเครื่องคำนวณจึงใช้สูตรของ Marmur-Doty

• ความยาว (N) = 19
• จำนวน G = 5, จำนวน C = 5 ดังนั้น N_GC = 10 และปริมาณ GC เท่ากับ 10 / 19 × 100 ≈ 52.6%
• Tm = 64.9 + 41 × (10 − 16.4) / 19 = 64.9 + 41 × (−6.4) / 19 = 64.9 − 13.8 ≈ 51.1 °C

สูตรนี้ใช้จำนวน GC คือ 10 ไม่ใช่เปอร์เซ็นต์ GC คือ 52.6 หากใช้เปอร์เซ็นต์โดยไม่ตั้งใจ จะได้ค่า Tm ใกล้เคียง 143 °C ซึ่งไม่ใช่ค่าที่สมเหตุสมผลสำหรับปฏิกิริยา PCR ที่ทำงานระหว่าง 50 °C ถึง 95 °C

วิธีใช้เครื่องคำนวณนี้

พิมพ์หรือวางลำดับเบสของไพรเมอร์โดยใช้เฉพาะตัวอักษร A, T, G และ C เครื่องคำนวณจะแสดงความยาวลำดับเบสเป็นนิวคลีโอไทด์ (nt) ปริมาณ GC เป็นเปอร์เซ็นต์ และอุณหภูมิการจับคู่สายที่คำนวณได้ในหน่วยองศาเซลเซียส ผลลัพธ์สามารถคัดลอกไปใช้ในบันทึกห้องปฏิบัติการหรือโพรโทคอลได้

การเลือกอุณหภูมิการจับคู่สายใน PCR

Tm เป็นค่าประมาณจากการคำนวณ ไม่ใช่อุณหภูมิการทำงานที่รับประกันได้ โพรโทคอล PCR หลายฉบับเริ่มขั้นตอนการจับคู่สายจริงที่อุณหภูมิต่ำกว่า Tm ที่คำนวณได้ไม่กี่องศา แล้วปรับตามผลที่เห็นบนเจล สำหรับไพรเมอร์เป็นคู่ โดยปกติจะใช้ค่า Tm ที่ต่ำกว่าของไพรเมอร์ทั้งสองเป็นจุดเริ่มต้น Gradient PCR ซึ่งทำปฏิกิริยาหลายชุดที่ช่วงอุณหภูมิต่างกันพร้อมกัน เป็นวิธีทั่วไปในการหาอุณหภูมิที่ดีที่สุดด้วยการทดสอบ

วิธีอื่นในการประมาณค่า Tm

สูตรของ Marmur-Doty และ Wallace ที่ใช้ในที่นี้เป็นค่าประมาณอย่างรวดเร็วซึ่งอาศัยเพียงองค์ประกอบของเบส ยังมีวิธีอื่นอีก ได้แก่

• อุณหพลศาสตร์แบบเพื่อนบ้านใกล้สุดคำนึงถึงผลของคู่เบสที่อยู่ติดกันแต่ละคู่ต่อเสถียรภาพ และถือเป็นวิธีที่แม่นยำกว่าสำหรับไพรเมอร์มาตรฐาน
• สูตรที่ปรับแก้ตามเกลือจะเพิ่มค่าปรับแก้ตามความเข้มข้นของไอออน Na+ หรือ K+ ในบัฟเฟอร์ของปฏิกิริยา เนื่องจากความเข้มข้นของเกลือที่สูงขึ้นช่วยทำให้ดีเอ็นเอสายคู่เสถียรขึ้นและทำให้ Tm สูงขึ้น

เครื่องคำนวณแต่ละแบบอาจรายงานค่า Tm ของไพรเมอร์เดียวกันแตกต่างกัน เพราะใช้สูตรต่างกัน การทำ PCR และตรวจสอบผลยังคงเป็นการทดสอบขั้นสุดท้าย

คำถามที่พบบ่อย

อุณหภูมิการจับคู่สายดีเอ็นเอคืออะไร?

คืออุณหภูมิที่ไพรเมอร์ดีเอ็นเอจับกับลำดับเบสที่ตรงกันบนสายแม่แบบระหว่าง PCR โดยทั่วไปห้องปฏิบัติการจะตั้งอุณหภูมินี้ให้ต่ำกว่าอุณหภูมิหลอมเหลว (Tm) ที่คำนวณได้ของไพรเมอร์ไม่กี่องศา

คำนวณค่า Tm ของไพรเมอร์อย่างไร?

สำหรับไพรเมอร์ที่มี 14 เบสขึ้นไป Tm = 64.9 + 41 × (จำนวน GC − 16.4) / ความยาว สำหรับไพรเมอร์ที่สั้นกว่า 14 เบส Tm = 2 × (จำนวน A+T) + 4 × (จำนวน G+C)

เหตุใดปริมาณ GC จึงทำให้ Tm สูงขึ้น?

คู่เบส G-C สร้างพันธะไฮโดรเจนสามพันธะ ขณะที่คู่เบส A-T สร้างสองพันธะ ไพรเมอร์ที่มีสัดส่วนเบส G และ C สูงกว่าจะต้องใช้พลังงานมากกว่า และจึงต้องใช้อุณหภูมิสูงกว่าในการแยกออกจากเป้าหมาย

อุณหภูมิการจับคู่สายใน PCR ควรเท่ากับ Tm ที่คำนวณได้หรือไม่?

ไม่ควร โพรโทคอลส่วนใหญ่เริ่มที่อุณหภูมิต่ำกว่า Tm ที่คำนวณได้หลายองศาแล้วจึงปรับจากจุดนั้น เนื่องจาก Tm เป็นจุดที่มีไพรเมอร์จับอยู่เพียงครึ่งหนึ่ง

ความยาวของไพรเมอร์เปลี่ยนค่า Tm หรือไม่?

เปลี่ยน แต่ไม่ได้เปลี่ยนอย่างง่าย ๆ ความยาวอยู่ในตัวส่วนของสูตร Marmur-Doty ดังนั้นไพรเมอร์ที่ยาวกว่าและมีปริมาณ GC ปานกลางจึงไม่ได้มี Tm สูงกว่าไพรเมอร์ที่สั้นกว่าและมี GC สูงโดยอัตโนมัติ

เหตุใดเครื่องคำนวณ Tm ต่างชนิดจึงให้ผลไม่ตรงกัน?

เครื่องคำนวณเหล่านั้นใช้สูตรต่างกัน กฎของ Wallace สูตรปริมาณ GC ของ Marmur-Doty อุณหพลศาสตร์แบบเพื่อนบ้านใกล้สุด และสูตรที่ปรับแก้ตามเกลือ อาจให้ค่า Tm ของไพรเมอร์เดียวกันแตกต่างกันได้ โดยบางครั้งต่างกันหลายองศา

เอกสารอ้างอิง

1. Marmur J, Doty P. การกำหนดองค์ประกอบเบสของกรดดีออกซีไรโบนิวคลีอิกจากอุณหภูมิการเสียสภาพด้วยความร้อนของกรดดังกล่าว. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. การไฮบริไดเซชันของโอลิโกดีออกซีไรโบนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์กับดีเอ็นเอ phi chi 174. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. มุมมองแบบรวมเกี่ยวกับอุณหพลศาสตร์แบบเพื่อนบ้านใกล้สุดของดีเอ็นเอพอลิเมอร์ ดีเอ็นเอรูปดัมเบล และโอลิโกนิวคลีโอไทด์. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.