Máy Tính Hiệu Suất qPCR: Công Cụ Phân Tích Đường Cong Chuẩn

Máy tính hiệu suất qPCR

Máy tính hiệu suất qPCR ước tính mức độ một phản ứng PCR định lượng (qPCR) sao chép trình tự DNA đích qua mỗi chu kỳ khuếch đại. Công cụ này sử dụng các giá trị Ct (số chu kỳ tại đó tín hiệu huỳnh quang vượt qua một ngưỡng đặt trước) từ một dãy pha loãng để tính hiệu suất, hệ số góc, tung độ gốc và R².

Hiệu suất qPCR là gì?

PCR định lượng theo dõi tín hiệu huỳnh quang khi phản ứng sao chép trình tự DNA đích qua từng chu kỳ. Hiệu suất khuếch đại mô tả mức tăng của lượng DNA đích trong mỗi chu kỳ. Ở hiệu suất 100%, lượng DNA đích tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ.

Các phản ứng thực tế hiếm khi đạt đúng 100%. Hầu hết phòng thí nghiệm xem hiệu suất trong khoảng từ 90% đến 110% là chấp nhận được để định lượng đáng tin cậy. Giá trị dưới 90% hoặc trên 110% cho thấy có vấn đề, chẳng hạn như thiết kế mồi kém, chất ức chế PCR còn sót lại từ quá trình tách chiết mẫu hoặc sai sót khi hút pipet trong dãy pha loãng.

Hiệu suất đặc biệt quan trọng khi so sánh biểu hiện gen giữa các mẫu. Phương pháp ΔΔCt phổ biến để tính mức thay đổi gấp bội giả định mọi phản ứng đều có hiệu suất 100%. Khi hiệu suất đo được khác 100%, hoặc khi gen đích và gen tham chiếu có hiệu suất khác nhau, kết quả thay đổi gấp bội có thể không chính xác.

Công thức tính hiệu suất qPCR

Hiệu suất được tính từ hệ số góc của đường chuẩn, là đường thẳng tạo thành khi biểu diễn các giá trị Ct theo lôgarit cơ số 10 (log10) của lượng DNA ban đầu trong một dãy pha loãng.

E = 10^(-1/slope) - 1

E là hiệu suất, được biểu diễn dưới dạng số thập phân (nhân với 100 để đổi sang phần trăm). Hệ số góc là hệ số góc của đường chuẩn. Giá trị này âm vì Ct tăng khi lượng DNA ban đầu giảm.

Hệ số góc -3,32 tương ứng với hiệu suất 100%:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

Kết quả này hợp lý vì một lần pha loãng 10 lần sẽ làm Ct dịch chuyển khoảng 3,32 chu kỳ nếu phản ứng tăng gấp đôi lượng DNA sau mỗi chu kỳ, bởi vì log2(10) xấp xỉ 3,32.

Trong thực tế, hệ số góc từ -3,1 đến -3,6 được xem là chấp nhận được. Khoảng này tương ứng với hiệu suất khoảng từ 90% đến 110%. Hệ số góc càng gần -3,1 thì hiệu suất tính được càng cao; càng gần -3,6 thì hiệu suất càng thấp.

Cách tính hiệu suất qPCR: Phương pháp đường chuẩn

1. Chuẩn bị một dãy pha loãng. Bắt đầu với mẫu có nồng độ cao nhất và pha loãng theo một hệ số cố định, thường là 10 lần, cho mỗi mẫu tiếp theo. Tiến hành qPCR trên từng độ pha loãng và ghi lại giá trị Ct.
2. Chuyển mỗi độ pha loãng thành giá trị log10. Gọi mẫu đầu tiên, có nồng độ cao nhất, là vị trí 0; mẫu thứ i có log10 (lượng tương đối) bằng -i × log10 (hệ số pha loãng).
3. Biểu diễn Ct (trục dọc) theo giá trị log10 (trục ngang) cho mọi độ pha loãng và thực hiện hồi quy tuyến tính.
4. Đọc hệ số góc, tung độ gốc và R² của đường hồi quy.
5. Thay hệ số góc vào E = 10^(-1/slope) - 1 để tính hiệu suất.

Tiêu chí chất lượng đường chuẩn

• R² ít nhất là 0,98. Chỉ số này đo mức độ các điểm dữ liệu khớp với một đường thẳng. Giá trị thấp hơn thường cho thấy có sai sót khi hút pipet hoặc sự khuếch đại không nhất quán.
• Hệ số góc nằm trong khoảng -3,1 đến -3,6. Khoảng này tương ứng với hiệu suất 90–110%.
• Ít nhất ba điểm pha loãng. Năm hoặc sáu điểm cho đường hồi quy đáng tin cậy hơn và giúp phát hiện điểm ngoại lệ dễ hơn.
• Mẫu có nồng độ cao nhất nên cho Ct khoảng 15-20. Mẫu pha loãng nhất nên có Ct dưới 35, vì các giá trị cao hơn mức này tiến gần giới hạn phát hiện.

Ví dụ minh họa

Một dãy pha loãng năm điểm, với hệ số pha loãng 10 lần, cho các giá trị Ct sau đây, từ nồng độ cao nhất đến thấp nhất: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Các giá trị log10 (lượng tương đối) là 0, -1, -2, -3, -4, vì mỗi bước pha loãng thêm -log10(10), tức là -1. Ct tăng 3,5 chu kỳ ở mỗi bước, nên các điểm nằm trên một đường thẳng và hồi quy tuyến tính cho kết quả:

• Hệ số góc: -3,5
• Tung độ gốc: 15,0
• R²: 1,0

Hiệu suất: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931, hay khoảng 93%.

Hiệu suất 93% với R² = 1,0 đáp ứng các tiêu chí chất lượng tiêu chuẩn và phù hợp để định lượng biểu hiện gen.

Ví dụ mã

Hàm JavaScript này thực hiện cùng phương pháp với máy tính. Chỉ số của mỗi giá trị Ct được đổi dấu trước khi lấy log, vì mẫu đầu tiên, có nồng độ cao nhất, có lượng tương đối lớn nhất và mỗi mẫu tiếp theo bị pha loãng hơn.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Vì sao hiệu suất quan trọng đối với biểu hiện gen

Các phép tính thay đổi gấp lần, bao gồm phương pháp ΔΔCt, giả định mọi phản ứng đều làm tăng gấp đôi lượng đích sau mỗi chu kỳ. Khi gen đích và gen tham chiếu có hiệu suất đo được khác nhau, công thức ΔΔCt thông thường sẽ gây sai số. Khi hiệu suất chênh lệch hơn khoảng năm điểm phần trăm, các nhà nghiên cứu thường chuyển sang phép tính hiệu chỉnh theo hiệu suất, chẳng hạn như phương pháp do Michael Pfaffl mô tả vào 2001. Hướng dẫn MIQE, một bộ tiêu chuẩn báo cáo được trích dẫn rộng rãi cho qPCR, được công bố vào 2009, khuyến nghị các nghiên cứu báo cáo hiệu suất tính được, hệ số góc và R² cùng với kết quả định lượng.

Các câu hỏi thường gặp

Hiệu suất qPCR bao nhiêu phần trăm là tốt?

Khoảng từ 90% đến 110% thường được chấp nhận, trong đó các xét nghiệm được tối ưu hóa tốt thường đạt khoảng 95–105%. Hệ số góc -3,32 tương ứng chính xác với hiệu suất 100%.

Vì sao hiệu suất qPCR của tôi cao hơn 110%?

Các nguyên nhân thường gặp gồm sai sót khi hút pipet trong dãy pha loãng, dimer mồi, chất ức chế ảnh hưởng không đồng đều đến các mẫu đậm đặc và pha loãng, hoặc ngưỡng huỳnh quang được đặt ngoài pha khuếch đại lũy thừa. Đường cong nóng chảy có nhiều hơn một đỉnh có thể cho thấy dimer mồi.

Vì sao hiệu suất qPCR của tôi thấp hơn 90%?

Các nguyên nhân có thể gồm thiết kế mồi kém, chất ức chế PCR còn sót lại từ quá trình tách chiết mẫu hoặc nhiệt độ bắt cặp không tối ưu. Kiểm tra tính đặc hiệu của mồi và chạy một dải nhiệt độ có thể giúp xác định nguyên nhân.

Giá trị R² thấp có nghĩa là gì?

R² đo mức độ các giá trị Ct khớp với một đường thẳng theo logarit của lượng chất. Giá trị dưới 0,98 cho thấy có thể tồn tại sự không nhất quán khi hút pipet, mẫu bị ức chế hoặc một điểm pha loãng nằm gần giới hạn phát hiện.

Đường chuẩn cần bao nhiêu điểm pha loãng?

Ít nhất ba điểm, là số tối thiểu cần cho hồi quy tuyến tính. Năm hoặc sáu điểm cho hệ số góc đáng tin cậy hơn và giúp phát hiện các điểm ngoại lệ dễ hơn.

Hiệu suất có thể thay đổi giữa các thí nghiệm không?

Có. Lô thuốc thử mới, mẻ mồi mới, loại mẫu khác hoặc thiết bị qPCR khác đều có thể làm thay đổi hiệu suất. Nhiều phòng thí nghiệm kiểm tra lại hiệu suất vài tháng một lần hoặc mỗi khi sử dụng lô thuốc thử mới.

Tài liệu tham khảo

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA và cộng sự. Hướng dẫn MIQE: thông tin tối thiểu để công bố các thí nghiệm PCR định lượng thời gian thực. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
2. Pfaffl MW. Một mô hình toán học mới để định lượng tương đối trong RT-PCR thời gian thực. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
3. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Ước tính hiệu suất PCR chính xác đến mức nào: Khuyến nghị để đánh giá hiệu suất qPCR chính xác và đáng tin cậy. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.