Tính toán hiệu suất PCR từ các giá trị Ct và hệ số pha loãng. Phân tích các đường chuẩn, xác định hiệu suất khuếch đại và xác thực các thí nghiệm PCR định lượng của bạn.
Giá trị phải là dương
Giá trị phải là dương
Giá trị phải là dương
Giá trị phải là dương
Giá trị phải là dương
Nhập dữ liệu hợp lệ để tạo biểu đồ
Hiệu suất qPCR là một thước đo cho việc phản ứng PCR hoạt động tốt như thế nào. Một hiệu suất 100% có nghĩa là lượng sản phẩm PCR gấp đôi sau mỗi chu kỳ trong giai đoạn tăng sinh.
Hiệu suất được tính toán từ độ dốc của đường chuẩn, được thu được bằng cách vẽ các giá trị Ct so với logarithm của nồng độ mẫu ban đầu (chuỗi pha loãng).
Hiệu suất (E) được tính bằng công thức:
E = 10^(-1/slope) - 1
Hiệu suất của phản ứng Polymerase Chain Reaction định lượng (qPCR) là một tham số quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến độ chính xác và độ tin cậy của các thí nghiệm qPCR của bạn. Trình tính hiệu suất qPCR giúp các nhà nghiên cứu xác định cách mà các phản ứng PCR của họ khuếch đại các chuỗi DNA mục tiêu một cách hiệu quả với mỗi chu kỳ nhiệt. Các phản ứng qPCR lý tưởng nên có hiệu suất từ 90-110%, cho thấy rằng lượng sản phẩm PCR gần như gấp đôi với mỗi chu kỳ trong giai đoạn tăng trưởng hàm mũ.
Hiệu suất khuếch đại kém có thể dẫn đến định lượng không chính xác, kết quả không đáng tin cậy và kết luận thí nghiệm sai lầm. Bằng cách tính toán và theo dõi hiệu suất qPCR của bạn, bạn có thể tối ưu hóa điều kiện phản ứng, xác thực thiết kế mồi và đảm bảo chất lượng dữ liệu PCR định lượng của bạn.
Trình tính này sử dụng phương pháp đường chuẩn, phương pháp này vẽ giá trị ngưỡng chu kỳ (Ct) so với logarit của nồng độ mẫu (được đại diện bởi các pha loãng liên tiếp), để xác định hiệu suất của thí nghiệm qPCR của bạn. Độ dốc của đường chuẩn này sau đó được sử dụng để tính toán hiệu suất khuếch đại bằng một công thức toán học đơn giản.
Hiệu suất của một phản ứng qPCR được tính toán từ độ dốc của đường chuẩn bằng công thức sau:
Trong đó:
Đối với một phản ứng PCR lý tưởng với hiệu suất 100% (gấp đôi hoàn hảo các sản phẩm amplicon với mỗi chu kỳ), độ dốc sẽ là -3.32. Điều này là do:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (hoặc 100%)}
Phần trăm hiệu suất được tính bằng cách nhân hiệu suất thập phân với 100:
\text{Hiệu suất (%)} = E \times 100\%
Đường chuẩn được tạo ra bằng cách vẽ các giá trị Ct (trục y) so với logarit của nồng độ mẫu ban đầu hoặc hệ số pha loãng (trục x). Mối quan hệ giữa các biến này nên là tuyến tính, và chất lượng của mối quan hệ tuyến tính này được đánh giá bằng hệ số xác định (R²).
Để có các tính toán hiệu suất qPCR đáng tin cậy:
Chuẩn bị dữ liệu: Trình tính sẽ lấy các giá trị Ct của bạn cho mỗi điểm pha loãng và hệ số pha loãng làm đầu vào.
Biến đổi log: Dãy pha loãng được biến đổi thành thang logarit (log cơ số 10).
Phân tích hồi quy tuyến tính: Trình tính thực hiện phân tích hồi quy tuyến tính trên dữ liệu đã biến đổi log để xác định độ dốc, giao điểm y và giá trị R².
Tính toán hiệu suất: Sử dụng giá trị độ dốc, hiệu suất được tính toán bằng công thức E = 10^(-1/slope) - 1.
Diễn giải kết quả: Trình tính sẽ hiển thị hiệu suất dưới dạng phần trăm, cùng với độ dốc và giá trị R² để giúp bạn đánh giá độ tin cậy của thí nghiệm qPCR của bạn.
Thực hiện theo các bước sau để tính toán hiệu suất qPCR của bạn:
Đặt số lượng pha loãng: Chọn số điểm pha loãng bạn có trong đường chuẩn (giữa 3-7 điểm được khuyến nghị).
Nhập hệ số pha loãng: Nhập hệ số pha loãng được sử dụng giữa các mẫu liên tiếp (ví dụ: 10 cho một dãy pha loãng 10 lần, 5 cho một dãy pha loãng 5 lần).
Nhập các giá trị Ct: Nhập các giá trị Ct cho mỗi điểm pha loãng. Thông thường, pha loãng đầu tiên (Pha loãng 1) chứa nồng độ mẫu cao nhất, dẫn đến giá trị Ct thấp nhất.
Xem kết quả: Trình tính sẽ tự động tính toán và hiển thị:
Diễn giải kết quả: Đánh giá xem hiệu suất qPCR của bạn có nằm trong khoảng chấp nhận (90-110%) và liệu giá trị R² có chỉ ra một đường chuẩn đáng tin cậy (≥ 0.98) hay không.
Sao chép kết quả: Sử dụng nút "Sao chép Kết quả" để sao chép tất cả các giá trị đã tính toán cho hồ sơ hoặc công bố của bạn.
Hãy cùng đi qua một ví dụ:
Khi được vẽ trên một đường chuẩn:
Trình tính sẽ thực hiện hồi quy tuyến tính và xác định:
Sử dụng công thức hiệu suất:
Điều này cho thấy hiệu suất qPCR tốt là 93%, nằm trong khoảng chấp nhận từ 90-110%.
Trước khi sử dụng một cặp mồi mới cho các thí nghiệm định lượng, việc xác thực hiệu suất của nó là rất quan trọng. Tính toán hiệu suất qPCR giúp:
Khi phát triển các thí nghiệm qPCR mới, các tính toán hiệu suất là rất quan trọng để:
Trong các thí nghiệm định lượng tương đối, việc biết hiệu suất PCR là rất cần thiết cho:
Trong các môi trường lâm sàng và chẩn đoán, hiệu suất qPCR là quan trọng để:
Đối với các ứng dụng an toàn thực phẩm và môi trường, các tính toán hiệu suất giúp:
Mặc dù phương pháp đường chuẩn là phương pháp phổ biến nhất để tính toán hiệu suất qPCR, nhưng có các phương pháp thay thế:
Phương pháp này tính toán hiệu suất từ dữ liệu phát quang của một đường khuếch đại duy nhất, mà không cần một dãy pha loãng. Phần mềm như LinRegPCR phân tích giai đoạn hàm mũ của các phản ứng riêng lẻ để xác định hiệu suất.
Ưu điểm:
Nhược điểm:
PCR kỹ thuật số (dPCR) cung cấp định lượng tuyệt đối mà không cần đường chuẩn hoặc tính toán hiệu suất.
Ưu điểm:
Nhược điểm:
Một số phần mềm phân tích qPCR cung cấp các phương pháp định lượng so sánh ước tính hiệu suất mà không cần một đường chuẩn hoàn chỉnh.
Ưu điểm:
Nhược điểm:
Sự phát triển của qPCR và các tính toán hiệu suất đã tiến triển đáng kể trong vài thập kỷ qua:
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được phát minh bởi Kary Mullis vào năm 1983, cách mạng hóa sinh học phân tử. Tuy nhiên, PCR truyền thống chỉ có thể định tính hoặc bán định lượng. Hệ thống PCR thời gian thực đầu tiên được phát triển vào đầu những năm 1990 bởi Russell Higuchi và các đồng nghiệp, những người đã chứng minh rằng việc theo dõi các sản phẩm PCR khi chúng tích lũy (sử dụng phát quang ethidium bromide) có thể cung cấp thông tin định lượng.
Khi công nghệ qPCR phát triển, các nhà nghiên cứu đã nhận ra tầm quan trọng của việc chuẩn hóa và xác thực. Khái niệm hiệu suất PCR trở thành trung tâm cho việc định lượng đáng tin cậy:
Lĩnh vực này tiếp tục phát triển với:
Ngày nay, việc tính toán và báo cáo hiệu suất qPCR được coi là thiết yếu cho việc công bố dữ liệu qPCR đáng tin cậy, và các công cụ như trình tính này giúp các nhà nghiên cứu tuân thủ các thực tiễn tốt nhất trong lĩnh vực này.
1' Công thức Excel để tính toán hiệu suất qPCR từ độ dốc
2' Đặt vào ô B2 nếu độ dốc nằm ở ô A2
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Công thức Excel để chuyển đổi hiệu suất thành phần trăm
6' Đặt vào ô C2 nếu hiệu suất thập phân nằm ở ô B2
7=B2*100
8
9' Hàm để tính toán hiệu suất từ các giá trị Ct và hệ số pha loãng
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Tính toán hồi quy tuyến tính
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Tính độ dốc
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Tính hiệu suất
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
331# Hàm R để tính toán hiệu suất qPCR từ các giá trị Ct và hệ số pha loãng
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Tạo các giá trị pha loãng log
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Thực hiện hồi quy tuyến tính
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Trích xuất độ dốc và R-bình phương
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Tính toán hiệu suất
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Trả về kết quả
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Ví dụ sử dụng
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Hiệu suất: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Độ dốc: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-bình phương: %.4f\n", results$r_squared))
321import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Tính toán hiệu suất qPCR từ các giá trị Ct và hệ số pha loãng.
8
9 Tham số:
10 ct_values (list): Danh sách các giá trị Ct
11 dilution_factor (float): Hệ số pha loãng giữa các mẫu liên tiếp
12
13 Trả về:
14 dict: Từ điển chứa hiệu suất, độ dốc, r_squared và giao điểm
15 """
16 # Tạo các giá trị pha loãng log
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Thực hiện hồi quy tuyến tính
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Tính toán hiệu suất
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Vẽ đường chuẩn với đường hồi quy.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Tạo các điểm cho đường hồi quy
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Pha Loãng')
48 plt.ylabel('Giá Trị Ct')
49 plt.title('Đường Chuẩn qPCR')
50
51 # Thêm phương trình và R² vào biểu đồ
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Hiệu suất = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Ví dụ sử dụng
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Hiệu suất: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Độ dốc: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-bình phương: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Giao điểm: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Vẽ đường chuẩn
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
761/**
2 * Tính toán hiệu suất qPCR từ các giá trị Ct và hệ số pha loãng
3 * @param {Array<number>} ctValues - Mảng các giá trị Ct
4 * @param {number} dilutionFactor - Hệ số pha loãng giữa các mẫu liên tiếp
5 * @returns {Object} Đối tượng chứa hiệu suất, độ dốc, rSquared và giao điểm
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Tạo các giá trị pha loãng log
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Tính toán trung bình cho hồi quy tuyến tính
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Tính độ dốc và giao điểm
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // Tính R-bình phương
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Tính toán hiệu suất
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Ví dụ sử dụng
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Hiệu suất: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Độ dốc: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-bình phương: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Giao điểm: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60Hiệu suất qPCR tốt thường nằm trong khoảng từ 90% đến 110% (0.9-1.1). Một hiệu suất 100% đại diện cho việc gấp đôi hoàn hảo sản phẩm PCR với mỗi chu kỳ. Các hiệu suất ngoài khoảng này có thể chỉ ra các vấn đề với thiết kế mồi, điều kiện phản ứng hoặc sự hiện diện của các chất ức chế.
Các hiệu suất lớn hơn 100% có thể xảy ra do:
Một giá trị R² thấp (dưới 0.98) cho thấy sự không tuyến tính trong đường chuẩn của bạn, có thể do:
Để có các tính toán hiệu suất qPCR đáng tin cậy, tối thiểu 3 điểm pha loãng là cần thiết, nhưng 5-6 điểm được khuyến nghị cho kết quả chính xác hơn. Những điểm này nên trải dài trên toàn bộ dải động của các nồng độ mẫu dự kiến trong các mẫu thí nghiệm của bạn.
Trong định lượng tương đối sử dụng phương pháp ΔΔCt, giả định rằng các hiệu suất giữa các gen mục tiêu và gen tham chiếu là bằng nhau (lý tưởng là 100%). Khi các hiệu suất khác nhau đáng kể:
Không, hiệu suất nên được xác định cho mỗi cặp mồi và nên được xác thực lại:
Các chất ức chế PCR có thể:
Các thuật ngữ thường được sử dụng thay thế cho nhau, nhưng:
Để cải thiện hiệu suất qPCR:
Việc so sánh các mẫu có hiệu suất khác nhau đáng kể không được khuyến nghị vì:
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. Các hướng dẫn MIQE: thông tin tối thiểu cho việc công bố các thí nghiệm PCR định lượng thời gian thực. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
Pfaffl MW. Một mô hình toán học mới cho định lượng tương đối trong RT-PCR thời gian thực. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Hiệu suất ước lượng: liên kết giữa nền và độ thiên lệch trong phân tích dữ liệu qPCR định lượng. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. Thí nghiệm qPCR Tối Ưu: Tạo ra Dữ Liệu Đáng Công Bố, Có Thể Tái Lập Ngay Lần Đầu. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Hiệu suất khuếch đại: liên kết giữa nền và độ thiên lệch trong phân tích dữ liệu qPCR định lượng. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Phân tích PCR động học: theo dõi thời gian thực các phản ứng khuếch đại DNA. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
Bio-Rad Laboratories. Hướng Dẫn Ứng Dụng PCR Thời Gian Thực. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
Thermo Fisher Scientific. Hướng Dẫn PCR Thời Gian Thực. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
Trình Tính Hiệu Suất qPCR của chúng tôi cung cấp một công cụ đơn giản nhưng mạnh mẽ cho các nhà nghiên cứu để xác thực và tối ưu hóa các thí nghiệm PCR định lượng của họ. Bằng cách tính toán chính xác hiệu suất từ các đường chuẩn, bạn có thể đảm bảo định lượng đáng tin cậy, khắc phục các thí nghiệm gặp vấn đề và tuân thủ các thực tiễn tốt nhất trong thí nghiệm qPCR.
Hãy thử trình tính của chúng tôi hôm nay để cải thiện chất lượng và độ tin cậy của dữ liệu qPCR của bạn!
Khám phá thêm các công cụ có thể hữu ích cho quy trình làm việc của bạn