Calculadora de Nombre de Còpies d'ADN | Eina d'Anàlisi Genòmica

Calculadora del nombre de còpies d’ADN

Una calculadora del nombre de còpies d’ADN estima quantes còpies d’una seqüència diana hi ha en una mostra d’ADN. Funciona a partir de la concentració i el volum de la mostra, i de la freqüència amb què apareix la seqüència diana dins de la seqüència d’ADN més gran. Els laboratoris de biologia molecular utilitzen aquest tipus d’estimació per planificar experiments com la qPCR (reacció en cadena de la polimerasa quantitativa) abans de dur a terme una anàlisi més cara i precisa.

Què significa el nombre de còpies d’ADN

El nombre de còpies d’ADN és el nombre de vegades que una seqüència específica apareix en un genoma o una mostra. Un gen humà típic apareix dues vegades, una heretada de cada progenitor. Diversos factors poden modificar aquest nombre.

• Amplificació: més de dues còpies. Les cèl·lules canceroses sovint amplifiquen gens que impulsen el creixement, com ara HER2 en alguns tumors de mama.
• Deleció: menys de dues còpies, de vegades cap. Les delecions poden causar trastorns genètics.
• Duplicació: apareix una còpia addicional on només n’hi hauria d’haver una o dues.
• Variació del nombre de còpies (CNV): diferència normal en el nombre de còpies entre individus, present en una part significativa del genoma humà.

Fórmula del nombre de còpies d’ADN

La calculadora converteix el nombre d’ocurrències de la seqüència i la massa de la mostra en un nombre de còpies mitjançant aquesta fórmula:

$\text{Nombre de còpies} = \frac{\text{Ocurrències} \times \text{Concentració} \times \text{Volum} \times N_A}{\text{Longitud de l’ADN} \times 660 \times 10^{9}}$

On:

• Ocurrències — nombre de vegades que apareix la seqüència diana en tota la seqüència d’ADN, comptant per separat les coincidències superposades.
• Concentració — concentració d’ADN en nanograms per microlitre (ng/μL), que normalment es determina amb un espectrofotòmetre o un fluoròmetre.
• Volum — volum de la mostra en microlitres (μL).
• $N_A$ — nombre d’Avogadro, 6,022 × 10²³ molècules per mol. Converteix els mols d’ADN en un nombre de molècules.
• Longitud de l’ADN — longitud de la seqüència completa d’ADN, en parells de bases.
• 660 — massa molecular mitjana d’un parell de bases d’ADN, en grams per mol (g/mol). Un parell de bases consta de dos nucleòtids aparellats, un de cada cadena d’ADN.
• 10⁹ — converteix els nanograms en grams.

La fórmula primer converteix la massa de la mostra en mols de molècules d’ADN, la multiplica pel nombre d’Avogadro per obtenir el nombre total de molècules d’ADN de la mostra i, després, multiplica aquest resultat pel nombre de vegades que apareix la seqüència diana en cada molècula.

L’eina només accepta les lletres A, T, C i G. Els espais i els salts de línia s’ignoren, i les lletres minúscules compten igual que les majúscules.

Com calcular el nombre de còpies d’ADN: exemple resolt

Prenem una seqüència d’ADN de 12 parells de bases, ATCGATCGATCG, amb una seqüència diana ATCG, una concentració de 10 ng/μL i un volum de 20 μL.

Pas 1: comptar les ocurrències. ATCG apareix 3 vegades a ATCGATCGATCG, en les posicions 1, 5 i 9.

Pas 2: determinar la massa total d’ADN. Concentració × volum = 10 × 20 = 200 ng.

Pas 3: convertir a mols. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Dividim per (12 parells de bases × 660 g/mol) = 7.920 g/mol. Això dona 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Pas 4: convertir en nombre de molècules. Multipliquem pel nombre d’Avogadro: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ molècules/mol ≈ 1,52 × 10¹³ molècules d’ADN.

Pas 5: multiplicar pel nombre d’ocurrències. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, és a dir, aproximadament 45.621.212.121.212 còpies.

Aquest nombre sembla enorme perquè una mostra de 20 μL a 10 ng/μL encara conté bilions de molècules curtes d’ADN. Les mostres reals solen utilitzar seqüències molt més llargues, cosa que redueix el nombre de molècules per a una mateixa massa.

Aplicacions de l’anàlisi del nombre de còpies d’ADN

Diagnòstic del càncer. Els laboratoris de patologia comproven el nombre de còpies de HER2 en el teixit tumoral mamari. Una cèl·lula normal en conté dues. Un tumor amplificat en pot portar sis o més, fet que afecta l’elegibilitat per a fàrmacs dirigits com el trastuzumab.

Proves de malalties genètiques. Trastorns com la síndrome de DiGeorge impliquen la deleció d’un segment cromosòmic. La síndrome de Down implica una còpia addicional del cromosoma 21 (trisomia 21). El recompte de còpies ajuda a confirmar aquests diagnòstics.

Quantificació de transgens i plasmidis. Els investigadors comproven quantes còpies d’un gen inserit s’han incorporat a una cèl·lula vegetal, animal o bacteriana. Normalment es prefereix una sola còpia, perquè diverses còpies poden induir la cèl·lula a silenciar el gen.

Monitoratge de patògens i de la càrrega vírica. Les estimacions del nombre de còpies permeten determinar quina quantitat d’ADN víric o bacterià hi ha en una mostra, una dada que s’utilitza per monitorar infeccions i en proves ambientals.

Altres mètodes per mesurar el nombre de còpies

Aquesta calculadora ofereix una estimació ràpida a partir de dades de seqüència i concentració. Els laboratoris que necessiten més precisió solen utilitzar un d’aquests mètodes:

• PCR quantitativa (qPCR): amplifica i mesura l’ADN en temps real; amb una bona corba estàndard, té una precisió aproximada del 15–20%.
• PCR digital (dPCR): divideix una mostra en milers de reaccions diminutes per fer un recompte directe, sense necessitat d’una corba estàndard.
• Hibridació fluorescent in situ (FISH): compta visualment les seqüències amb un microscopi directament en cèl·lules o cromosomes; és el mètode estàndard en molts laboratoris de diagnòstic del càncer.
• Seqüenciació de nova generació (NGS): seqüencia tota la mostra i perfila simultàniament el nombre de còpies a tot el genoma.

Preguntes més freqüents

Què és el nombre de còpies d’ADN? És el nombre de vegades que una seqüència d’ADN determinada apareix en un genoma o una mostra. La majoria dels gens humans apareixen dues vegades, una per progenitor. Les còpies addicionals o absents poden afectar la salut i el risc de patir malalties.

Quina precisió té aquesta calculadora? Ofereix una estimació teòrica basada en les dades introduïdes, no una mesura de laboratori. La precisió depèn de l’exactitud amb què s’hagi mesurat la concentració i de l’especificitat de la seqüència diana. Per obtenir resultats publicats, els mètodes com la PCR digital són més precisos.

Es pot utilitzar aquesta calculadora per a l’ARN? No. L’ARN utilitza uracil en lloc de timina i un sucre diferent, de manera que la seva massa molecular difereix de la de l’ADN. L’ARN té una massa molecular mitjana d’aproximadament 330 g/mol per nucleòtid, en comparació amb aproximadament 660 g/mol per parell de bases d’ADN. Aplicar la fórmula de l’ADN a dades d’ARN donaria una resposta incorrecta.

Per què una seqüència amb coincidències superposades compta més d’una vegada? La calculadora compta cada posició en què coincideix la seqüència diana, encara que les coincidències comparteixin lletres. A ATATAT, la seqüència ATA coincideix dues vegades, en la posició 1 i en la posició 3, perquè cada posició inicial es comprova de manera independent.

Quin interval de concentració d’ADN funciona millor? Les concentracions de 10–100 ng/μL proporcionen les lectures més fiables en els instruments de laboratori estàndard. Per sota de 10 ng/μL, l’error de mesura augmenta, i es recomana un mètode més sensible, com ara un fluoròmetre, en lloc d’un espectrofotòmetre estàndard.

Aquesta calculadora pot estimar el nombre de còpies d’un plasmidi? Sí. Introduïu la seqüència completa del plasmidi com a seqüència d’ADN i una regió única de la inserció com a seqüència diana, juntament amb la concentració de plasmidi mesurada i el volum de la mostra.