Calculadora de Temperatura d'Aparellament de DNA | Eina Gratuïta de Tm de PCR

Què és una calculadora de la temperatura d’anellament de l’ADN?

Una calculadora de la temperatura d’anellament de l’ADN estima la temperatura de fusió (Tm) d’un encebador d’ADN a partir de la seva seqüència. La Tm és la temperatura a la qual la meitat de les molècules d’encebador estan unides a la seva cadena diana i l’altra meitat no. En una reacció en cadena de la polimerasa (PCR), aquest valor orienta la temperatura utilitzada perquè els encebadors s’uneixin a la plantilla d’ADN.

Per què és important la temperatura d’anellament en la PCR

La PCR copia un fragment d’ADN diana mitjançant cicles repetits d’escalfament i refredament. Cada cicle té tres passos. Primer, l’escalfament separa la plantilla bicatenària a aproximadament 95 °C. Aquest pas s’anomena desnaturalització. En segon lloc, la reacció es refreda fins a la temperatura d’anellament, normalment entre 50 °C i 65 °C, perquè els encebadors curts es puguin unir a seqüències complementàries de les cadenes simples. En tercer lloc, la temperatura puja fins a aproximadament 72 °C, i un enzim anomenat ADN polimerasa allarga els encebadors per construir noves cadenes d’ADN.

Si la temperatura d’anellament és massa baixa, els encebadors s’uneixen a seqüències que només coincideixen parcialment, cosa que produeix fragments d’ADN addicionals no desitjats. Si és massa alta, els encebadors no poden formar un enllaç estable amb la plantilla i es copia poc ADN o gens. La temperatura d’anellament és un dels primers paràmetres que els investigadors ajusten quan una reacció de PCR falla.

Com afecta el contingut de GC la Tm

Un encebador s’aparella amb la seva diana mitjançant enllaços d’hidrogen. Un parell guanina-citosina (G-C) forma tres enllaços d’hidrogen. Un parell adenina-timina (A-T) en forma dos. Un encebador amb més bases G i C necessita més calor per separar-se, de manera que té una Tm més alta que un encebador de la mateixa longitud amb més bases A i T. El contingut de GC se sol expressar com un percentatge: el nombre de bases G i C dividit per la longitud total de la seqüència, multiplicat per 100.

Fórmula de la temperatura d’anellament de l’ADN

Aquesta calculadora aplica una de dues fórmules, escollida segons la longitud de l’encebador.

Per als encebadors de 14 nucleòtids o més, utilitza la fórmula de Marmur-Doty basada en el contingut de GC:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Aquí N_GC és el nombre de bases G i C de l’encebador, comptades directament i no com a percentatge. N és el nombre total de bases.

Per als encebadors de menys de 14 nucleòtids, utilitza la regla de Wallace:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G i C representen, cadascuna, el recompte d’aquella base en l’encebador.

Totes dues fórmules assumeixen unes condicions estàndard de 50 nanomolar d’encebador, 50 mil·limolar de Na+ i un pH de 7,0, i el punt de canvi de 14 bases entre l’una i l’altra segueix el mateix criteri.

Exemple pràctic

Prenem l’encebador de 19 bases ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. La seva longitud és 19, que és 14 o més, de manera que la calculadora utilitza la fórmula de Marmur-Doty.

• Longitud (N) = 19
• Recompte de G = 5, recompte de C = 5, de manera que N_GC = 10
• Contingut de GC = 10 / 19 × 100 ≈ 52,6 %
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19
• Tm = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19
• Tm = 64,9 − 13,8
• Tm ≈ 51,1 °C

La fórmula utilitza el recompte de GC, 10, no el percentatge de GC, 52,6. Utilitzar per error el percentatge dona una Tm propera a 143 °C, que no és un valor realista per a una reacció de PCR que funciona entre 50 °C i 95 °C.

Com s’utilitza aquesta calculadora

Escriviu o enganxeu la seqüència d’un encebador utilitzant només les lletres A, T, G i C. La calculadora mostra la longitud de la seqüència, el contingut de GC en percentatge i la temperatura d’anellament calculada. El resultat es pot copiar per a les notes de laboratori o per a un protocol.

Com triar una temperatura d’anellament per a la PCR

La Tm és una estimació calculada, no una temperatura de treball garantida. Molts protocols comencen el pas d’anellament real uns quants graus per sota de la Tm calculada i després l’ajusten segons el resultat obtingut en un gel. Per a una parella d’encebadors, normalment s’utilitza com a punt de partida el valor de Tm més baix dels dos encebadors. Una PCR en gradient, que realitza diverses reaccions alhora dins d’un interval de temperatures, és una manera habitual de trobar la temperatura òptima mitjançant proves.

Altres maneres d’estimar la Tm

Les fórmules de Marmur-Doty i de Wallace utilitzades aquí són aproximacions ràpides basades únicament en la composició de bases. També existeixen altres mètodes:

• La termodinàmica dels veïns més propers té en compte com afecta l’estabilitat cada parell de bases adjacents. Els autors d’una eina d’encebadors molt utilitzada la descriuen com el mètode preferit per a oligonucleòtids de 8 a 40 bases.
• Les fórmules ajustades a la concentració salina afegeixen una correcció per a la concentració dels ions Na+ o K+ del tampó de reacció, ja que una concentració salina més alta estabilitza el dúplex d’ADN i augmenta la Tm.

Diferents calculadores poden donar valors de Tm diferents per al mateix encebador perquè utilitzen fórmules diferents. Fer la PCR i comprovar-ne el resultat continua sent la prova definitiva.

Preguntes freqüents

Què és la temperatura d’anellament de l’ADN?

És la temperatura a la qual els encebadors d’ADN s’uneixen a la seqüència complementària d’una cadena plantilla durant la PCR. Als laboratoris, normalment s’estableix uns quants graus per sota de la temperatura de fusió (Tm) calculada de l’encebador.

Com es calcula la Tm d’un encebador?

Per als encebadors de 14 bases o més, Tm = 64,9 + 41 × (recompte de GC − 16,4) / longitud. Per als encebadors de menys de 14 bases, Tm = 2 × (nombre de bases A+T) + 4 × (nombre de bases G+C).

Per què el contingut de GC augmenta la Tm?

Els parells de bases G-C formen tres enllaços d’hidrogen, en comparació amb els dos dels parells A-T. Un encebador amb una proporció més alta de bases G i C necessita més energia i, per tant, una temperatura més alta per separar-se de la seva diana.

La temperatura d’anellament de la PCR ha de ser igual a la Tm calculada?

No. La majoria de protocols comencen diversos graus per sota de la Tm calculada i ajusten la temperatura a partir d’aquí, perquè la Tm marca el punt en què només la meitat de l’encebador està unida.

La longitud de l’encebador modifica la Tm?

Sí, tot i que no d’una manera simple. La longitud apareix al denominador de la fórmula de Marmur-Doty, de manera que un encebador més llarg amb un contingut mitjà de GC no té automàticament una Tm més alta que un de més curt i ric en GC.

Per què no coincideixen les diferents calculadores de Tm?

Utilitzen fórmules diferents. La regla de Wallace, la fórmula de Marmur-Doty basada en el contingut de GC, la termodinàmica dels veïns més propers i les fórmules ajustades a la concentració salina poden donar cadascuna una Tm diferent per al mateix encebador, de vegades amb diferències de diversos graus.

Referències

1. ROSALIND. What formula is used to calculate Melting Temperature (Tm)? ROSALIND Knowledge Hub — la regla de Wallace per a seqüències de menys de 14 bases, Tm = 64,9 + 41 × (G + C − 16,4) / N per a les més llargues, i els supòsits de 50 nM d’encebador, 50 mM de Na+ i pH 7,0.
2. SantaLucia J Jr. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. PMC19045 — el model dels veïns més propers, que suma les contribucions de cada parell de bases adjacents.
3. Kibbe WA. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Research, 2007. PMC1933198 — el mètode dels veïns més propers és el preferit per a oligonucleòtids d’entre 8 i 40 nt; la fórmula bàsica és la menys preferida.