Calculadora de Temperatura d'Aparellament de DNA | Eina Gratuïta de Tm de PCR

Què és una calculadora de la temperatura d’anellament de l’ADN?

Una calculadora de la temperatura d’hibridació de l’ADN estima la temperatura de fusió (Tm) d’un encebador d’ADN a partir de la seva seqüència. La Tm és la temperatura a la qual la meitat de les molècules d’encebador estan unides a la seva cadena diana i l’altra meitat no. En una reacció en cadena de la polimerasa (PCR), aquest valor orienta la temperatura utilitzada perquè els encebadors s’uneixin a la plantilla d’ADN.

Per què és important la temperatura d’anellament en la PCR

La PCR copia un fragment d’ADN diana mitjançant cicles repetits d’escalfament i refredament. Cada cicle té tres passos. Primer, l’escalfament separa la plantilla bicatenària a aproximadament 95 °C. Aquest pas s’anomena desnaturalització. En segon lloc, la reacció es refreda fins a la temperatura d’hibridació, normalment entre 50 °C i 65 °C, perquè els encebadors curts es puguin unir a seqüències complementàries de les cadenes simples. En tercer lloc, la temperatura puja fins a aproximadament 72 °C, i un enzim anomenat ADN polimerasa allarga els encebadors per construir noves cadenes d’ADN.

Si la temperatura d’hibridació és massa baixa, els encebadors s’uneixen a seqüències que només coincideixen parcialment, cosa que produeix fragments d’ADN addicionals no desitjats. Si és massa alta, els encebadors no poden formar un enllaç estable amb la plantilla i es copia poc ADN o gens. La temperatura d’hibridació és un dels primers paràmetres que els investigadors ajusten quan una reacció de PCR falla.

Com afecta el contingut de GC la Tm

Un encebador s’aparella amb la seva diana mitjançant enllaços d’hidrogen. Un parell guanina-citosina (G-C) forma tres enllaços d’hidrogen. Un parell adenina-timina (A-T) en forma dos. Un encebador amb més bases G i C necessita més calor per separar-se, de manera que té una Tm més alta que un encebador de la mateixa longitud amb més bases A i T. El contingut de GC se sol expressar com un percentatge: el nombre de bases G i C dividit per la longitud total de la seqüència, multiplicat per 100.

Fórmula de la temperatura d’anellament de l’ADN

Aquesta calculadora aplica una de dues fórmules, escollida segons la longitud de l’encebador.

Per als encebadors de 14 nucleòtids o més, utilitza la fórmula de Marmur-Doty basada en el contingut de GC:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Aquí N_GC és el nombre de bases G i C de l’encebador, comptades directament i no com a percentatge. N és el nombre total de bases.

Per als encebadors de menys de 14 nucleòtids, utilitza la regla de Wallace:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G i C representen, cadascuna, el recompte d’aquella base en l’encebador.

Ambdues fórmules assumeixen condicions habituals de PCR: aproximadament 50 nanomolar d’encebador i 50 mil·limolar de Na+.

Exemple resolt

Prenem l’encebador de 19 bases ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. La seva longitud és 19, que és 14 o més, de manera que la calculadora utilitza la fórmula de Marmur-Doty.

• Longitud (N) = 19
• Recompte de G = 5, recompte de C = 5, per tant N_GC = 10, i el contingut de GC és 10 / 19 × 100 ≈ 52,6 %
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

La fórmula utilitza el recompte de GC, 10, no el percentatge de GC, 52,6. Utilitzar per error el percentatge dona una Tm propera a 143 °C, que no és un valor realista per a una reacció de PCR que funciona entre 50 °C i 95 °C.

Com s’utilitza aquesta calculadora

Escriviu o enganxeu una seqüència d’encebador utilitzant només les lletres A, T, G i C. La calculadora mostra la longitud de la seqüència en nucleòtids (nt), el contingut de GC com a percentatge i la temperatura d’hibridació calculada en graus Celsius. El resultat es pot copiar per a les notes de laboratori o per a un protocol.

Com triar una temperatura d’anellament per a la PCR

La Tm és una estimació calculada, no una temperatura de treball garantida. Molts protocols comencen el pas d’hibridació real uns quants graus per sota de la Tm calculada i després l’ajusten segons el resultat obtingut en un gel. Per a una parella d’encebadors, normalment s’utilitza com a punt de partida el valor de Tm més baix dels dos encebadors. Una PCR en gradient, que realitza diverses reaccions alhora dins d’un interval de temperatures, és una manera habitual de trobar la temperatura òptima mitjançant proves.

Altres maneres d’estimar la Tm

Les fórmules de Marmur-Doty i de Wallace utilitzades aquí són aproximacions ràpides basades únicament en la composició de bases. També existeixen altres mètodes:

• La termodinàmica del veí més proper té en compte com afecta l’estabilitat cada parell de bases adjacents i es considera el mètode més precís per als encebadors estàndard.
• Les fórmules ajustades a la concentració salina afegeixen una correcció per a la concentració dels ions Na+ o K+ del tampó de reacció, ja que una concentració salina més alta estabilitza el dúplex d’ADN i augmenta la Tm.

Diferents calculadores poden donar valors de Tm diferents per al mateix encebador perquè utilitzen fórmules diferents. Fer la PCR i comprovar-ne el resultat continua sent la prova definitiva.

Preguntes més freqüents

Què és la temperatura d’anellament de l’ADN?

És la temperatura a la qual els encebadors d’ADN s’uneixen a la seqüència complementària d’una cadena motlle durant la PCR. Als laboratoris, normalment s’estableix uns quants graus per sota de la temperatura de fusió (Tm) calculada de l’encebador.

Com es calcula la Tm d’un encebador?

Per als encebadors de 14 bases o més, Tm = 64,9 + 41 × (recompte de GC − 16,4) / longitud. Per als encebadors de menys de 14 bases, Tm = 2 × (nombre de bases A+T) + 4 × (nombre de bases G+C).

Per què el contingut de GC augmenta la Tm?

Els parells de bases G-C formen tres enllaços d’hidrogen, en comparació amb els dos dels parells A-T. Un encebador amb una proporció més alta de bases G i C necessita més energia i, per tant, una temperatura més alta per separar-se de la seva diana.

La temperatura d’anellament de la PCR ha de ser igual a la Tm calculada?

No. La majoria de protocols comencen diversos graus per sota de la Tm calculada i ajusten la temperatura a partir d’aquí, perquè la Tm marca el punt en què només la meitat de l’encebador està unida.

La longitud de l’encebador modifica la Tm?

Sí, tot i que no d’una manera simple. La longitud apareix al denominador de la fórmula de Marmur-Doty, de manera que un encebador més llarg amb un contingut mitjà de GC no té automàticament una Tm més alta que un d’encara més curt i ric en GC.

Per què no coincideixen les diferents calculadores de Tm?

Utilitzen fórmules diferents. La regla de Wallace, la fórmula de Marmur-Doty basada en el contingut de GC, la termodinàmica del veí més proper i les fórmules ajustades a la concentració salina poden donar cadascuna una Tm diferent per al mateix encebador, de vegades amb diferències de diversos graus.

Referències

1. Marmur J, Doty P. Determinació de la composició de bases de l'àcid desoxiribonucleic a partir de la seva temperatura de desnaturalització tèrmica. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Hibridació d'oligodesoxiribonucleòtids sintètics amb l'ADN phi chi 174. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. Una visió unificada de la termodinàmica dels veïns més propers de l'ADN polimèric, en forma de manuella i oligonucleotídic. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.