DNA Kopital Beregner | Genomisk Analyseredskab

Beregner til DNA-kopital

En beregner til DNA-kopital estimerer, hvor mange kopier af en målsekvens der findes i en DNA-prøve. Den bruger prøvens koncentration, dens volumen og hvor ofte målsekvensen forekommer i den længere DNA-sekvens. Molekylærbiologiske laboratorier bruger denne type estimat til at planlægge eksperimenter som qPCR (kvantitativ polymerasekædereaktion), før de udfører en dyrere og mere præcis analyse.

Hvad DNA-kopital betyder

DNA-kopital er antallet af gange, en bestemt sekvens forekommer i et genom eller en prøve. Et typisk humant gen forekommer to gange, én gang nedarvet fra hver forælder. Flere forhold kan ændre dette antal.

• Amplifikation: flere end to kopier. Kræftceller amplificerer ofte gener, der driver vækst, såsom HER2 i nogle brysttumorer.
• Deletion: færre end to kopier, i nogle tilfælde ingen. Deletioner kan forårsage genetiske sygdomme.
• Duplikation: en ekstra kopi forekommer, hvor der kun burde være én eller to.
• Variation i kopital (CNV): en normal forskel i kopital mellem individer, som findes i en betydelig del af det menneskelige genom.

Formel for DNA-kopital

Beregneren omdanner antallet af sekvensforekomster og prøvens masse til et kopital ved hjælp af denne formel:

$\text{Kopital} = \frac{\text{Forekomster} \times \text{Koncentration} \times \text{Volumen} \times N_A}{\text{DNA-længde} \times 660 \times 10^{9}}$

Hvor:

• Forekomster — hvor mange gange målsekvensen forekommer i den fulde DNA-sekvens, idet overlappende match tælles separat.
• Koncentration — DNA-koncentrationen i nanogram pr. mikroliter (ng/μL), typisk aflæst med et spektrofotometer eller et fluorometer.
• Volumen — prøvevolumen i mikroliter (μL).
• $N_A$ — Avogadros tal, 6,022 × 10²³ molekyler pr. mol. Det omdanner stofmængden af DNA til et antal molekyler.
• DNA-længde — længden af den fulde DNA-sekvens i basepar.
• 660 — den gennemsnitlige molarmasse for ét DNA-basepar i gram pr. mol (g/mol). Et basepar består af to parrede nukleotider, ét fra hver DNA-streng.
• 10⁹ — omdanner nanogram til gram.

Formlen omdanner først prøvens masse til stofmængden af DNA-molekyler, multiplicerer med Avogadros tal for at få det samlede antal DNA-molekyler i prøven og multiplicerer derefter med det antal gange, målsekvensen forekommer i hvert molekyle.

Værktøjet accepterer kun bogstaverne A, T, C og G. Mellemrum og linjeskift ignoreres, og små bogstaver tæller på samme måde som store bogstaver.

Sådan beregnes DNA-kopital: regneeksempel

Betragt en DNA-sekvens på 12 basepar, ATCGATCGATCG, med en målsekvens på ATCG, en koncentration på 10 ng/μL og et volumen på 20 μL.

Trin 1: Tæl forekomster. ATCG forekommer 3 gange i ATCGATCGATCG (ved positionerne 1, 5 og 9).

Trin 2: Find den samlede DNA-masse. Koncentration × volumen = 10 × 20 = 200 ng.

Trin 3: Omdan til stofmængde. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Divider med (12 basepar × 660 g/mol) = 7.920 g/mol. Det giver 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Trin 4: Omdan til antal molekyler. Multiplicer med Avogadros tal: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ molekyler/mol ≈ 1,52 × 10¹³ DNA-molekyler.

Trin 5: Multiplicer med antallet af forekomster. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, eller cirka 45.621.212.121.212 kopier.

Dette tal ser enormt ud, fordi en prøve på 20 μL med 10 ng/μL stadig indeholder billioner af korte DNA-molekyler. Virkelige prøver bruger normalt meget længere sekvenser, hvilket reducerer antallet af molekyler ved samme masse.

Hvor analyse af DNA-kopital anvendes

Kræftdiagnostik. Patologilaboratorier undersøger kopitallet for HER2 i brysttumorvæv. En normal celle indeholder to kopier. En amplificeret tumor kan indeholde seks eller flere, hvilket påvirker muligheden for at få målrettede lægemidler som trastuzumab.

Test for genetiske sygdomme. Tilstande som DiGeorge-syndrom indebærer deletion af et kromosomsegment. Downs syndrom indebærer en ekstra kopi af kromosom 21 (trisomi 21). Optælling af kopier hjælper med at bekræfte disse diagnoser.

Kvantificering af transgener og plasmider. Forskere undersøger, hvor mange kopier af et indsat gen der er kommet ind i en plante-, dyre- eller bakteriecelle. En enkelt kopi foretrækkes normalt, fordi flere kopier kan få cellen til at slukke for genet.

Overvågning af patogener og virusmængde. Estimater af kopital sporer, hvor meget viralt eller bakterielt DNA der findes i en prøve, hvilket anvendes til overvågning af infektioner og miljøtestning.

Andre metoder til måling af kopital

Denne beregner giver et hurtigt estimat ud fra data om sekvens og koncentration. Laboratorier, der har brug for større præcision, bruger typisk i stedet en af disse metoder:

• Kvantitativ PCR (qPCR): amplificerer og måler DNA i realtid; er med en god standardkurve nøjagtig inden for cirka 15–20%.
• Digital PCR (dPCR): opdeler en prøve i tusindvis af små reaktioner til direkte optælling uden behov for en standardkurve.
• Fluorescens in situ-hybridisering (FISH): tæller sekvenser visuelt under et mikroskop direkte i celler eller kromosomer; standardmetoden i mange laboratorier for kræftdiagnostik.
• Sekventering med næste generations teknologi (NGS): sekventerer hele prøven og kortlægger kopiantallet i hele genomet på én gang.

Ofte stillede spørgsmål

Hvad er DNA-kopital? Det er antallet af gange, en given DNA-sekvens forekommer i et genom eller en prøve. De fleste humane gener forekommer to gange, én gang fra hver forælder. Ekstra eller manglende kopier kan påvirke helbredet og risikoen for sygdom.

Hvor nøjagtig er denne beregner? Den giver et teoretisk estimat baseret på de angivne input, ikke en laboratoriemåling. Nøjagtigheden afhænger af, hvor præcist koncentrationen blev målt, og hvor specifik målsekvensen er. Metoder som digital PCR er mere præcise til publicerede resultater.

Kan denne beregner bruges til RNA? Nej. RNA bruger uracil i stedet for thymin og et andet sukker, så molarmassen adskiller sig fra DNA's. RNA har en gennemsnitlig molarmasse på cirka 330 g/mol pr. nukleotid sammenlignet med cirka 660 g/mol pr. DNA-basepar. Hvis DNA-formlen anvendes på RNA-data, bliver resultatet forkert.

Hvorfor tælles en overlappende sekvens mere end én gang? Beregneren tæller hver position, hvor målsekvensen matcher, selv hvis matchene deler bogstaver. I ATATAT matcher sekvensen ATA to gange, ved position 1 og position 3, fordi hver startposition kontrolleres uafhængigt.

Hvilket interval for DNA-koncentration fungerer bedst? Koncentrationer på 10–100 ng/μL giver de mest pålidelige aflæsninger på standardlaboratorieinstrumenter. Under 10 ng/μL vokser målefejlen, og en mere følsom metode som et fluorometer anbefales frem for et standard-spektrofotometer.

Kan denne beregner estimere plasmidkopital? Ja. Indtast hele plasmidsekvensen som DNA-sekvensen og en unik region af insertet som målsekvensen sammen med den målte plasmidkoncentration og prøvevolumen.