Kalibrationskurvekalkulator | Lineær Regression til Laboratorieanalyse

Hvad er en beregner til kalibreringskurver

En beregner til kalibreringskurver omdanner instrumentaflæsninger til koncentrationer. Det gør den ved at tilpasse en ret linje gennem datapunkter fra standarder med kendt koncentration og derefter bruge linjen til at omdanne en ny aflæsning til en koncentration. Laboratorier bruger kalibreringskurver inden for kemi, biologi og miljøtest, når et instrument rapporterer et signal, f.eks. absorbans eller topareal, i stedet for en koncentration direkte.

Beregneren på denne side tilpasser en linje ved hjælp af lineær regression, altså mindste kvadraters metode. Den rapporterer hældningen, skæringen med y-aksen og R², som er et mål for, hvor tæt punkterne følger linjen. Den kan derefter estimere koncentrationen i en ukendt prøve ud fra en målt respons.

Formlen for en kalibreringskurve

En kalibreringskurve antager en lineær sammenhæng mellem koncentration og instrumentrespons:

$y = mx + b$

• $y$ er responsen (det, instrumentet måler)
• $x$ er koncentrationen
• $m$ er hældningen
• $b$ er skæringen med y-aksen

Sådan beregnes hældningen og skæringen

For et sæt med $n$ punkter er den hældning og skæring, der passer bedst til dataene (efter mindste kvadraters metode):

$m = \frac{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})(y_i - \bar{y})}{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})^2}$

$b = \bar{y} - m\bar{x}$

Her er $\bar{x}$ og $\bar{y}$ henholdsvis middelkoncentrationen og middelresponsen for alle punkterne.

Formel for R²

R², determinationskoefficienten, viser, hvor godt linjen passer til dataene:

$R^2 = 1 - \frac{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \hat{y}_i)^2}{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \bar{y})^2}$

$\hat{y}_i$ er den respons, som linjen forudsiger for hvert $x_i$. R² går fra 0 til 1. En værdi på 1 betyder, at hvert punkt ligger nøjagtigt på linjen.

Formel for ukendt koncentration

Når hældningen og skæringen er kendt, kan en målt respons $y$ omregnes til en koncentration:

$x = \frac{y - b}{m}$

Hvis denne beregning giver et negativt tal, rapporterer beregneren koncentrationen som 0, eftersom en negativ koncentration ikke er fysisk meningsfuld. Den rapporterer også 0, når den tilpassede hældning er 0, fordi en vandret linje ikke indeholder oplysninger om koncentrationen.

Regneeksempel

Antag, at fire standarder giver følgende resultater:

Middelkoncentrationen er 3, og middelresponsen er 0,20.

Hældning:

$m = \frac{(-3)(-0.15) + (-1)(-0.05) + (1)(0.04) + (3)(0.16)}{(-3)^2 + (-1)^2 + 1^2 + 3^2} = \frac{1.02}{20} = 0.0510$

Skæring:

$b = 0.20 - (0.0510)(3) = 0.0470$

R²: Når de forudsagte responser sammenlignes med de faktiske, fås R² = 0,9966.

Den tilpassede linje er:

$y = 0.0510x + 0.0470 \quad (R^2 = 0.9966)$

Antag nu, at en ukendt prøve giver en respons på 0,20. Dens koncentration er:

$x = \frac{0.20 - 0.0470}{0.0510} = 3.0000$

Sådan bruges denne beregner

1. Indtast hver standards kendte koncentration og målte respons som et talpar. Beregneren begynder med to rækker.
2. Vælg »Add Data Point« for at indtaste flere standarder, eller »Remove data point« ud for en række for at slette den. Der kræves mindst to punkter.
3. Når mindst to punkter er udfyldt, viser beregneren regressionsligningen, R²-værdien og en graf over punkterne med den tilpassede linje. Hældning, skæring, R² og koncentration afrundes alle til fire decimaler i visningen.
4. Indtast en målt respons under »Calculate Unknown Concentration« for at se den tilsvarende koncentration. Den opdateres automatisk, mens værdien indtastes; der er ingen separat knap, der skal trykkes på.
5. Vælg »Reset« for at rydde alle indtastede punkter og responsfeltet og begynde forfra.

Fortolkning af hældning, skæring og R²

Hældningen viser, hvor meget responsen ændrer sig pr. koncentrationsenhed. En større hældning betyder, at metoden reagerer kraftigt på små ændringer i koncentrationen.

Skæringen er den forudsagte respons ved nul koncentration. Den afspejler baggrundssignalet, f.eks. fra en blindprøve eller instrumentets baseline. En skæring, der ikke er nul, er almindelig og er ikke automatisk et problem, men en stor eller uensartet skæring mellem kalibreringer kan pege på kontaminering eller en instrumentfejl.

R² viser, hvor tæt punkterne følger en ret linje. Værdier over 0,99 er typiske for en velfungerende lineær metode. En lavere R²-værdi kan skyldes pipetteringsfejl, en nedbrudt standard eller et koncentrationsområde, hvor responsen ikke længere er lineær.

Hvor kalibreringskurver anvendes

Kalibreringskurver er almindelige, når et instruments råsignal skal omdannes til en koncentration:

• Spektrofotometri — lysets absorbans måles og omdannes til koncentration, f.eks. ved måling af protein- eller pigmentindhold.
• Kromatografi (HPLC, GC) — peakareal eller -højde fra et kromatogram omdannes til koncentration, hvilket er almindeligt ved lægemiddeltest og miljøanalyser.
• ELISA og andre immunoassays — farve- eller fluorescensintensitet målt med en mikropladelæser omdannes til antigen- eller antistofkoncentration.
• qPCR — tærskelcyklusværdier fra seriefortyndinger af en kendt prøve danner en kurve, der bruges til at estimere mængden af genetisk materiale i en ukendt prøve.

Når en ret linje ikke passer

Nogle metoder er ikke lineære over hele deres område. Almindelige løsninger er at begrænse kalibreringen til et smallere, lineært område, anvende en logaritmisk transformation før tilpasning af en linje, bruge en polynomiel tilpasning (en kurve) eller anvende vægtet regression, når målefejlen vokser eller aftager med koncentrationen. Denne beregner tilpasser kun en ret linje; hvis punkterne tydeligt danner en kurve, er resultaterne mindre pålidelige, og der kan være behov for en anden model.

Ofte stillede spørgsmål

Hvad er en kalibreringskurve?

En kalibreringskurve er en linje, der er tilpasset instrumentaflæsninger for prøver med kendt koncentration. Den bruges til at omdanne en ny aflæsning fra en prøve med ukendt koncentration til en koncentrationsværdi.

Hvor mange datapunkter skal en kalibreringskurve bruge?

Beregneren skal bruge mindst to punkter for at tilpasse en linje, men to punkter kan ikke vise, om den sande sammenhæng faktisk er lineær. De fleste laboratorier bruger fem til otte standarder, der spænder over det forventede område for de ukendte prøver.

Hvad betyder R² i en kalibreringskurve?

R² måler, hvor tæt datapunkterne følger den tilpassede linje, på en skala fra 0 til 1. En værdi på 1 betyder, at hvert punkt ligger nøjagtigt på linjen. Værdier over 0,99 betragtes generelt som et stærkt tegn på en lineær sammenhæng.

Kan koncentrationer estimeres uden for standardernes område?

Det er upålideligt at estimere en koncentration under den laveste standard eller over den højeste standard, fordi der ikke findes data, som bekræfter, at linjen forbliver ret dér. Det er bedre at fortynde en prøve, der giver en for høj aflæsning, eller koncentrere en, der giver en for lav aflæsning, og måle igen inden for det kalibrerede område.

Hvorfor vises den beregnede koncentration nogle gange som 0?

Hvis en målt respons er lavere end den tilpassede skæring (med en positiv hældning), giver formlen $x = (y - b) / m$ et negativt tal. Beregneren viser 0 i dette tilfælde, eftersom en reel koncentration ikke kan være negativ. Den viser også 0, når hældningen er 0, hvilket sker, hvis alle standarder har samme respons, eller hvis alle standarder har samme koncentration.

Hvad er forskellen mellem hældningen og skæringen?

Hældningen beskriver, hvor følsom responsen er over for en ændring i koncentrationen. Skæringen er den respons, der forudsiges ved nul koncentration, og den afspejler ofte baggrundssignalet snarere end selve analytten.